一種熒光修飾環(huán)糊精及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及環(huán)糊精的熒光修飾方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)糊精(cyclodextrin)是由6?12個(gè)D-葡萄糖分子以1，4_糖苷鍵連接的環(huán)狀低聚糖化合物，結(jié)構(gòu)為中空?qǐng)A筒形，是制備包合物的最常用的載體材料。藥物分子與環(huán)糊精分子通過范德華力形成包合物后，能夠提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)液體藥物如揮發(fā)油的固體劑型化，掩蓋藥物的不良?xì)馕痘蛭兜?，調(diào)節(jié)釋放速率，提高藥物的生物利用度，降低藥物的刺激性與毒副作用，因此，環(huán)糊精材料在藥學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。常用的環(huán)糊精材料有環(huán)糊精、羥丙基環(huán)糊精、甲基環(huán)糊精等。環(huán)糊精除了直接應(yīng)用以夕卜，還可以用于制備包合物脂質(zhì)體、包合物納米粒等新劑型。
[0003]為了準(zhǔn)確測(cè)定環(huán)糊精的載藥效果以及環(huán)糊精從新劑型中的釋放效果，除了測(cè)定藥物含量以外，往往還需要測(cè)定環(huán)糊精的含量。但是，環(huán)糊精沒有紫外吸收，這給含量測(cè)定帶來了很大的難題。目前，環(huán)糊精的分析方法主要是應(yīng)用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器測(cè)定，該方法能夠測(cè)定輕丙基-環(huán)糊精的下限為2mmol/L(約相當(dāng)于3.lmg/mL)(趙清等，天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27 (5):15-17);能夠測(cè)定環(huán)糊精的下限為0.lmg/mL(于嘉鑫等，藥物分析雜志，2011，31 (4) =749-751)?？梢?，該方法的靈敏度不高，只能測(cè)定mg/mL數(shù)量級(jí)的濃度，對(duì)于低濃度的樣品無法應(yīng)用。
[0004]環(huán)糊精的含量測(cè)定難題帶來的另一個(gè)問題就是入胞行為評(píng)價(jià)的困難。目前對(duì)基于環(huán)糊精構(gòu)建靶向納米載體的研究較多(司晶星等，高分子通報(bào)，2013，(11):1-10)，在評(píng)價(jià)靶向性時(shí)往往要開展環(huán)糊精入胞效率的評(píng)價(jià)，但是由于環(huán)糊精的定量問題，常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)儀器如流式細(xì)胞儀或激光共聚焦都很難測(cè)定環(huán)糊精在細(xì)胞內(nèi)的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有環(huán)糊精含量測(cè)定方法靈敏度低且無法評(píng)價(jià)入胞行為的技術(shù)問題，本發(fā)明提供應(yīng)用焚光探針--異硫氰酸焚光素(fluorescein isoth1cyanate，F(xiàn)ITC)修飾環(huán)糊精的方法，通過熒光修飾后應(yīng)用熒光分光光度法或高效液相色譜-熒光檢測(cè)器分析能夠顯著提高環(huán)糊精含量測(cè)定的靈敏度，從而有利于研究含有環(huán)糊精劑型的載藥效果與釋放行為，F(xiàn)ITC修飾環(huán)糊精后，通過流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡等常規(guī)儀器也可以方便地研究環(huán)糊精的細(xì)胞攝取行為，從而為含有環(huán)糊精的劑型優(yōu)化提供了評(píng)價(jià)方法。
[0006]由此，本發(fā)明提供一種熒光修飾環(huán)糊精的制備方法，包括如下步驟，均需要避光操作:
[0007]I)將FITC溶解于二甲基亞砜中制成溶液；
[0008]2)按照FITC與環(huán)糊精的分子摩爾比0.1?20:1稱取環(huán)糊精或其衍生物，并溶于水中制成濃度為10?500mg/mL環(huán)糊精溶液，溶液的體積為FITC溶液的9?11倍；
[0009]3)將FITC溶液加入環(huán)糊精溶液中，磁力攪拌12?36h ;
[0010]4)加入5?10倍體積的無水乙醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，產(chǎn)物用純水溶解；
[0011 ] 5)將產(chǎn)物溶液轉(zhuǎn)移到分子量為1500?2000D的透析袋中，用100倍體積純水室溫透析6?10次，每次8?12h，以去除游離的FITC ；
[0012]6)透析袋內(nèi)液體冷凍干燥，即得FITC修飾的環(huán)糊精粉末。
[0013]所述環(huán)糊精或其衍生物選自α-環(huán)糊精、羥丙基-α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、γ -環(huán)糊精、羥丙基-γ-環(huán)糊精、2，6-二甲基-β-環(huán)糊精或麥芽糖基-β-環(huán)糊精中的一種。
[0014]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，上述FITC與環(huán)糊精的分子摩爾比為0.5?10:1。
[0015]作為本發(fā)明的一種更優(yōu)選方案，上述FITC與環(huán)糊精的分子摩爾比為1:1。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述環(huán)糊精或其衍生物優(yōu)選為羥丙基-β -環(huán)糊精。其濃度優(yōu)選為100mg/mL，同時(shí) FITC 濃度為 30mg/mL。
[0016]作為本發(fā)明的更進(jìn)一步改進(jìn)，步驟(3)中所述磁力攪拌溫度為25°C ;步驟(3)總經(jīng)歷時(shí)間，即反應(yīng)時(shí)間為24h。
[0017]同時(shí)本發(fā)明提供上述熒光修飾環(huán)糊精的制備方法制備所得的熒光修飾環(huán)糊精。以及含有該熒光修飾環(huán)糊精和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
[0018]有益效果
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所制備的FITC修飾環(huán)糊精并不影響環(huán)糊精的包合效果，并且修飾后，由于FITC熒光檢測(cè)的靈敏度高，使得與未修飾環(huán)糊精相比，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度檢測(cè)環(huán)糊精含量的靈敏度大為提高。FITC熒光分光光度法能夠測(cè)定的下限為0.1lng/mL，而制得的環(huán)糊精中含有FITC的含量約為0.4%?I %，即可以測(cè)定的環(huán)糊精的濃度的下限約為27.5?110ng/mL，與目前采用效液相色譜-示差折光檢測(cè)器測(cè)定環(huán)糊精的方法相比(濃度下限能夠達(dá)到0.lmg/mL)，靈敏度提高了 909?2636倍，從而可以方便地測(cè)定含有環(huán)糊精新劑型的含量、釋放度等藥學(xué)性質(zhì)。
[0020]此外，環(huán)糊精熒光修飾以后，也能夠非常方便地檢測(cè)環(huán)糊精的細(xì)胞攝取行為，可以方便地評(píng)價(jià)環(huán)糊精的靶向遞藥效果。
【附圖說明】
[0021]圖1紅外圖譜驗(yàn)證:圖中A:HP-0-CD(羥丙基-β-環(huán)糊精)深灰色，B = FITC(異硫氰酸熒光素)中灰色，C:FITC-HP-13-⑶(異硫氰酸熒光素修飾的羥丙基-β-環(huán)糊精)淺灰色。
[0022]圖2環(huán)糊精從脂質(zhì)體中的釋放度研究=FITC-HP- β -⑶組為游離環(huán)糊精從透析袋中的釋放，以驗(yàn)證其能夠快速通過透析袋。
[0023]圖3環(huán)糊精的入胞行為研究(流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果)=P-C-L即為環(huán)糊精脂質(zhì)體，P代表表面采用PEG修飾，C代表環(huán)糊精，L代表脂質(zhì)體。
[0024]圖4環(huán)糊精的入胞行為研究(激光共聚焦照片):P-C-L-s即為環(huán)糊精脂質(zhì)體，P代表表面采用PEG修飾，C代表環(huán)糊精，L代表脂質(zhì)體，s代表磷脂組成為SPC即大豆磷脂。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，其中部分制備條件僅是作為典型情況的說明，并非是對(duì)本發(fā)明的限定。
[0026]實(shí)施例1 FITC修飾羥丙基-β -環(huán)糊精(FITC-ΗΡ- β -CD)的制備與含量測(cè)定
[0027]精密稱取FITC30mg溶于DMSOlmL中，將其加入1mLl % HP-β -CD溶液，25 °C磁力攪拌24h后，加入無水乙醇lOOmL，旋蒸去除溶劑，用純水定容至10mL，將溶液轉(zhuǎn)移至1500?2000Da的透析袋中，25°C透析72h (透析液為100ml的純水，每8h更換一次透析液)以除去游離的FITC，冷凍干燥制得FITC-HP-β-⑶，全部操作需避光。用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)495nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm，焚光法測(cè)定FITC的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y = 208.1X-6.7(R2= 0.999)線性范圍:0.11?2.60ng/mL，測(cè)得產(chǎn)物中FITC含量為0.96%。
[0028]實(shí)施例2 FITC修飾β -環(huán)糊精(FITC- β -CD)的制備與含量測(cè)定
[0029]精密稱取FITClOOmg溶于DMSOlmL中，將其加入1mLl.5% β-CD溶液，25°C磁力攪拌36h后，加入無水乙醇lOOmL，旋蒸去除溶劑，用純水定容至10mL，將溶液轉(zhuǎn)移至1500?2000Da的透析袋中，25°C透析60h (透析液為1000ml的純水，每1h更換一次透析液)以除去游離的FITC，冷凍干燥制得FITC-β-⑶，全部操作需避光。用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，方法同實(shí)施例1，測(cè)得產(chǎn)物中FITC含量為0.42%。
[0030]實(shí)施例3 FITC修飾羥丙基-γ -環(huán)糊精(FITC-ΗΡ- γ -CD)的制備與含量測(cè)定
[0031]精密稱取FITClOmg 溶于 DMSOlmL 中，將其加入 1mL0.5 % HP-γ-CD 溶液，25°C磁力攪拌12h后，加入無水乙醇lOOmL，旋蒸去除溶劑，用純水定容至10mL，將溶液轉(zhuǎn)移至1500?2000Da的透析袋中，25°C透析80h (透析液為1000ml的純水，每8h更換一次透析液)以除去游離的FITC，冷凍干燥制得FITC-HP-γ-⑶，全部操作需避光。用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，方法同實(shí)施例1，測(cè)得產(chǎn)物中FITC含量為0.63%。
[0032]實(shí)施例4 FITC修飾羥丙基-β -環(huán)糊精(FITC-ΗΡ- β -CD)的包合效果
[0033]FITC-HP- β -CD的制備如實(shí)施例1。
[0034]飽和水溶液法制備9-硝基喜樹堿(9-NC)環(huán)糊精包合物:精密稱取9-NC溶于丙酮溶液中待用，F(xiàn)ITC-HP-β-CD 溶于純水 6m 中(9-NC:FITC-HP-β-CD = 1: 120，摩爾比)，60°C水浴、500r/min磁力攪拌，將9-NC丙酮溶液滴入FITC-HP- β -⑶溶液中繼續(xù)攪拌至揮盡丙酮。將制備好的包合物溶液趁熱過0.45 μ m的微孔濾膜除去游離藥物，冷凍干燥，即得。高效液相色譜法測(cè)得9-NC在制得的包合物中的含量為2.66mg/go
[0035]同法采用羥丙基-β -環(huán)糊精(HP- β -CD)包合9-NC，測(cè)得的9-NC含量為2.64mg/go說明FITC修飾后對(duì)環(huán)糊精包合效果沒有影響。
[0036]實(shí)施例5 FITC修飾羥丙基-β -環(huán)糊精的驗(yàn)證
[0037]FITC-HP- β -CD的制備如實(shí)施例1。
[0038]將FITC、HP- β -CD及FITC-HP- β -CD的紅外圖譜進(jìn)行比對(duì)(圖1)，F(xiàn)ITC在1593cm1出現(xiàn)苯環(huán)的峰，ΗΡ-β-⑶結(jié)構(gòu)中沒有苯環(huán)因此在1593cm 1沒有峰，二者合成的FITC-HP-β -⑶在1593cm 1出現(xiàn)苯環(huán)的峰，因此可以證明FITC成功修飾HP-β -⑶。
[0039]實(shí)施例6本發(fā)明的應(yīng)用:FITC修飾羥丙基-β -環(huán)糊精從脂質(zhì)體中的釋放度研究
[0040]采用乙醇注入法制備。精密稱取大豆磷脂SPC180mg、DSPE-PEG2QQQ34mg溶解于無水乙醇5mL中，精密稱取FITC-HP- β -⑶250mg溶于純水5mL中，60°C水浴磁力攪拌，將乙醇溶液注入到水溶液中，不斷攪拌至揮盡乙醇，取出用純水定容至5mL，400W探頭超聲5min，100rpm離心lOmin，即得環(huán)糊精脂質(zhì)體。
[0041]釋放介質(zhì)為pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液(處方中含137mmol/LNaCl、3mmol/LKCl、8mmol/LNaHP04、lmmol/LKH2P04)。精密吸取 1.5mLFITC_HP- β -CD 和環(huán)糊精脂質(zhì)體于透析袋中(FITC總濃度為12000ng)，置于10mL釋放介質(zhì)中，37°C、500r/min透析，于不同時(shí)間點(diǎn)精密吸取適量介質(zhì)分別按實(shí)施例1下方法和文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器(趙清等，天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27 (5):15-17)測(cè)定FITC濃度，并補(bǔ)充相同量的等溫空白釋放介質(zhì)。
[0042]結(jié)果因?yàn)殪`敏度問題，高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器未能測(cè)得環(huán)糊精的濃度，而采用熒光分光光度法測(cè)得了環(huán)糊精的濃度并計(jì)算出釋放度，如圖2所示。圖2中FITC-HP-β -⑶組為游離環(huán)糊精從透析袋中的釋放，可知其能夠快速通過透析袋。由此可知通過熒光標(biāo)記環(huán)糊精可以考察環(huán)糊精的釋放行為。
[0043]實(shí)施例7本發(fā)明的應(yīng)用:FITC修飾羥丙基-β -環(huán)糊精的入胞行為研究
[0044]含有FITC-HP- β -⑶的環(huán)糊精脂質(zhì)體(P_C_L)的制備方法如實(shí)