Peg化亮丙瑞林的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及PEG修飾的亮丙瑞林藥物偶合物及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 亮丙瑞林是人工合成的黃體生成激素釋放激素（LHRH，亦名促性腺激素釋放激素， GnRH)的高活性衍生物，是GnRH拮抗劑，為多肽類藥物。它可以刺激垂體分泌促性腺激素， 誘發(fā)生殖器官生成類固醇。長(zhǎng)期大量使用會(huì)抑制垂體分泌促性腺激素及睪丸或卵巢留類的 生成，可治療或緩解多種性激素依賴性疾病如前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、性早 熟等。
[0003] 目前亮丙瑞林的緩控釋微球注射液在臨床上得以應(yīng)用，其高分子載體材料為 PLGA，屬于混懸劑，最常用的制備方法是復(fù)乳法（w/o/w法），其應(yīng)用存在一些不足：微球粒 徑范圍一般為1~500μm，小的可以是幾納米，大的可達(dá)800μm，所需注射針頭較粗，注射 部位會(huì)有疼痛、硬結(jié)或發(fā)紅等刺激；微球的粒徑不均一，藥物釋放受影響；若材料降解性不 好易引起炎癥反應(yīng)，患者順應(yīng)性較差；只作為皮下給藥，靜脈注射可能會(huì)引起血栓形成。
[0004] 聚乙二醇（PEG)由多個(gè)重復(fù)的氧乙烯基組成，是一種兩親性良好的聚合物。其化 學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)抗原性，毒性小，且生物相容性已通過(guò)FDA認(rèn)證。作為修飾劑與蛋白質(zhì)或多 肽類藥物結(jié)合后，許多優(yōu)良性能隨之轉(zhuǎn)移到PEG化后的藥物中。與蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合時(shí)，可 作為一種屏障遮擋住其分子表面的抗原決定簇，避免抗體的產(chǎn)生，或者阻止抗原與抗體的 結(jié)合，抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生，即降低免疫原性和免疫反應(yīng)性。PEG化后的藥物分子增大，腎小 球過(guò)濾減少，有助于蛋白質(zhì)或多肽類藥物循環(huán)半衰期的延長(zhǎng)。蛋白質(zhì)或多肽在經(jīng)水溶性的 PEG大分子修飾后，熱穩(wěn)定性、抗酸堿能力、抗變性劑能力及抗酶解能力均有明顯提高，穩(wěn)定 性增強(qiáng)。經(jīng)PEG修飾后的蛋白質(zhì)或多肽，毒性比修飾之前低，不少修飾的蛋白質(zhì)的藥效還有 明顯提高。此外，蛋白質(zhì)或多肽經(jīng)PEG修飾后可以制備成各種劑型直接給藥，既與微球一樣 達(dá)到緩釋的目的，又減少了副作用，提高了患者的順應(yīng)性。
[0005] 目前已有多種通過(guò)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)的PEG修飾的蛋白質(zhì)和多肽藥物，如PEG修 飾的腺苷脫氫酶（PEG-ADA)、PEG修飾的天冬酰胺酶（PEG-asparaginase)、PEG修飾的干擾 素a-2a(peginterferonalfa_2a)、PEG修飾的干擾素a-2b(peginterferonalfa_2b)、 PEG修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子等。
[0006]PEG在與蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合之前需要進(jìn)行活化。PEG功能基團(tuán)為其末端的羥基，反 應(yīng)活性低，只能在較劇烈的條件下與其他基團(tuán)結(jié)合，可能會(huì)使蛋白質(zhì)或多肽失活，因此，必 需將PEG進(jìn)行活化，以便在溫和的條件下，以較高的反應(yīng)速率與蛋白質(zhì)或多肽偶聯(lián)。
[0007]蛋白質(zhì)或多肽分子中存在多個(gè)氨基，偶合后得到的產(chǎn)物通常是多種交聯(lián)產(chǎn)物的混 合物，而且PEG的分子大小及分子結(jié)構(gòu)，對(duì)修飾后的蛋白質(zhì)或多肽空間結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及活性 方面均有影響。亮丙瑞林的PEG偶合物目前還沒(méi)有相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及一種PEG-亮丙瑞林偶聯(lián)物及其制備方法，目的在于保持亮丙瑞林活 性的前提下，提高藥物的穩(wěn)定性，增加藥物的緩釋作用，減輕過(guò)敏反應(yīng)，具有用藥更安全、更 長(zhǎng)效的功能。
[0009] 具體地，本發(fā)明在于提供一種在亮丙瑞林Ser殘基上的羥基進(jìn)行PEG化的PEG-亮 丙瑞林偶合物，所述偶合物具有如下通式：
[0010] R0-(CH2CH20)n-Mal-Leuprorelin或其分支型
[0011] 式中，R為Η或C1~C4烷基，優(yōu)選為甲基；
[0012] η為100到1000整數(shù)值，優(yōu)選為200~500之間的整數(shù)，聚乙二醇的分子量在5~ 40kDa之間，優(yōu)選為20kDa。
[0013] 具體地，先將PEG與馬來(lái)酸酐連接，再形成活潑酯，然后通過(guò)化學(xué)方法以共價(jià)鍵 偶聯(lián)到帶保護(hù)的亮丙瑞林上，經(jīng)TFA溶液去保護(hù)，形成通式為D-L的偶合物，其中D為 PEG-Mal，L為亮丙瑞林。
[0014] 具體地，該偶合物為單一位點(diǎn)修飾的PEG-Mal偶合物。
[0015] 本發(fā)明中，所述與亮丙瑞林偶聯(lián)的聚乙二醇為琥珀酰亞胺基活化的單甲氧基聚乙 二醇。聚乙二醇分子根據(jù)偶聯(lián)度不同，可以是分子量為5~40KDa的任一分子，其中優(yōu)選分 子量為20kDa的聚乙二醇分子。聚乙二醇分子可以是直鏈型或分支型，可以是單鏈、雙鏈或 多鏈。優(yōu)選直鏈型單鏈聚乙二醇分子。
[0016] 本發(fā)明PEG-亮丙瑞林偶聯(lián)物中，亮丙瑞林既包括亮丙瑞林，也包括醋酸亮丙瑞 林。
[0017] 另外本發(fā)明還提供了該偶合物的制備方法，其工藝如下：
[0018]

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為PEG化亮丙瑞林大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0021] 實(shí)施例1制備PEG-Mal-亮丙瑞林
[0022] 1. 1PEG-MAL樣品（2)的制備
[0023] 將不同分子量的單甲氧基聚乙二醇PEG分別溶于適量的二氯甲烷中，加入2當(dāng)量 的吡啶為縛酸劑，加入5當(dāng)量的馬來(lái)酸酐，溫控60°C，反應(yīng)8h，濃縮，異丙醚析晶體得到不同 分子量的一端為羧基的單甲氧基聚乙二醇。
[0024] 1. 2PEG-MAL-OSu樣品（3)的制備
[0025] 將不同分子量的一端為羧基的單甲氧基聚乙二醇PEG-MAL分別溶于適量的THF， 加入HOSu，DCC，攪拌，有大量白色固體析出，過(guò)濾，異丙醚析晶，過(guò)濾，用適量水、異丙醚洗 滌，真空干燥得不同分子量的PEG-MAL-OSu。
[0026] 1. 3PEG-Mal-ProLeuprorelin樣品（5)的制備
[0027] 用100mMpH5. 5的NaH2P04-H3P0#l沖液溶液溶解帶保護(hù)的亮丙瑞林以配置成3mg/ mL的溶液，分別與不同分子量的聚乙二醇修飾劑PEG-MAL-OSu進(jìn)行修飾，ProLeuprorelin: PEG-MAL-OSu為1:5的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，在4°C下反應(yīng)24h后，加入1M的甘氨酸終止反應(yīng)， 經(jīng)葡聚糖凝膠Superdex200柱層析純化，濃縮，冷凍干燥得到產(chǎn)物。
[0028] 1. 4PEG-Mal-Leuprorelin樣品（6)的制備
[0029] 不同分子量的聚乙二醇修飾劑PEG-MAL-ProLeuprorelin分別加入至 TFA:Tis:H20(95:2. 5:2. 5)的溶液中，室溫?cái)嚢?~5h，經(jīng)異丙醚沉降，過(guò)濾，用葡聚糖凝膠 Superdex200柱層析純化，濃縮，冷凍干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。
[0030] 實(shí)施例2PEG-Mal-亮丙瑞林的修飾條件
[0031] 1、反應(yīng)pH值對(duì)修飾產(chǎn)物的影響
[0032] 取帶保護(hù)的亮丙瑞林，分別用100mmol/LPB緩沖液（pH4. 0、pH5. 0、pH5. 5 和pH6· 0)配成 2mg/mL。按摩爾比l:3(ProLeuprorelin:PEG-MAL-〇Su_2〇KD)稱 取PEG-MAL-0SU-20KD加入亮丙瑞林反應(yīng)溶液中，4 °C條件下lOOrprn攪拌反應(yīng)24h， 加入1M的甘氨酸終止反應(yīng)，經(jīng)葡聚糖凝膠Superdex200柱層析純化，濃縮，加入至 TFA:Tis:H20(95:2. 5:2. 5)的溶液中，室溫?cái)嚢?~5h，經(jīng)異丙醚沉降，過(guò)濾，用葡聚糖凝 膠Superdex200柱層析純化，濃縮，冷凍干燥。分別取樣采用酶聯(lián)免疫吸附分析法，確定 PEG-Mal-亮丙瑞林的修飾率。
[0033] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：pH值在4. 0、5. 0、5. 5、6. 0的條件下，PEG-Mal-亮丙瑞林所占比例 分別為19 %，30 %，60 %，23 %。說(shuō)明pH4. 0的修飾率最低，pH5. 5的條件下修飾率最高。
[0034] 2、亮丙瑞林與PEG的修飾比例對(duì)修飾產(chǎn)物的影響
[0035] 取帶保護(hù)的亮丙瑞林，分別用pH5. 5,100mmol/LPB緩沖液配成2mg/mL。按 ProLeuprorelin:PEG-MAL-0Su-20KD摩爾比A(l:l)、B(l:2)、C(l:3)、D(l:4)、E(l:5)、 F(l:8)、G(1:10)分別稱取PEG-MAL-0Su-20KD加入亮丙瑞林反應(yīng)溶液中，4°C條件下lOOrpm 攪拌反應(yīng)24h，加入1M的甘氨酸終止反應(yīng)，經(jīng)葡聚糖凝膠Superdex200柱層析純化，濃縮， 加入至TFA:Tis:H20 (95:2. 5:2. 5)的溶液中，室溫?cái)嚢?~5h，經(jīng)異丙醚沉降，過(guò)濾，用葡聚 糖凝膠Superdex200柱層析純化，濃縮，冷凍干燥。分別取樣采用酶聯(lián)免疫吸附分析法，確 定PEG-Mal-亮丙瑞林的修飾率。
[0036]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ProLeuprorelin:PEG-MAL-0Su-20KD摩爾比A(l: 1)、B(l:2)、 C(1:3)、D(1:4)、E(1:5)、F(1:8)、G(1:10)時(shí)，PEG-Mal-亮丙瑞林所占比例分別為 17%， 29%，39%，45%，60 %、62%，61 %。當(dāng)ProLeuprorelin:PEG-MAL-0SU-20KD摩爾比達(dá)到 1:5 后，不能進(jìn)一步提尚修飾率。
[0037] 3、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)修飾產(chǎn)物的影響
[0038] 取帶保護(hù)的亮丙瑞林溶液，分別用pH5. 5,100mm〇l/LPB緩沖液配成2mg/mL，按 ProLeuprorelin:PEG-MAL-0SU-20KD摩爾比 1:5 稱取PEG-MAL-0SU-20KD加入亮丙瑞林反應(yīng) 溶液中，分別在4°C反應(yīng)24h，25°C反應(yīng)12h不同時(shí)間點(diǎn)，加入1M的甘氨酸終止反應(yīng)，經(jīng)葡聚 糖凝膠Superdex200柱層析純化，濃縮，加入至TFA:Tis:H20 (95:2. 5:2. 5)的溶液中，室溫 攪拌3~5h，經(jīng)異丙醚沉降，過(guò)濾，用葡聚糖凝膠Superdex200柱層析純化，濃縮，冷凍干 燥。分別取樣采用酶聯(lián)免疫吸附分析法，確定PEG-Mal-亮丙瑞林的修飾率。
[0039] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：4°C條件下通過(guò)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，同樣能達(dá)到25°C條件下反應(yīng)的修 飾率。但4°C條件修飾更利于亮丙瑞林的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0040] 4、ProLeuprorelin濃度對(duì)修飾產(chǎn)物的影響
[0041] 取帶保護(hù)的亮丙瑞林溶液，分別用pH5. 5，100mmol/LPB緩沖液配成l.Omg/ mL，2. 0mg/mL，3. 0mg/mL，4. 0mg/mL按ProLeuprorelin與PEG-MAL-〇Su_20KD摩爾