芽孢桿菌dy26-004及其在防治植物致病真菌的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及芽孢桿菌，尤其是涉及一株芽孢桿菌DY26-004及其在制備防治植物 致病真菌發(fā)酵上清液中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物病害一直是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用不僅催 生了病原菌的抗藥性，而且農(nóng)藥殘留對人、畜和環(huán)境都有危害。生物防治是利用有益生物 或其產(chǎn)物來抑制或消滅有害生物的一種方法，由于其無毒害、無污染和不易產(chǎn)生抗藥性的 優(yōu)點，使其成為防治植物病害研究中的一個新方向（Calvoetal. 2007)。細菌由于生長周 期短，代謝易于調(diào)控，可通過發(fā)酵實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的特點，被廣泛應(yīng)用于植物病害防治的研 究。芽胞桿菌（Bacillus)、假單胞菌（Pseudomonas)、節(jié)桿菌（Arthrobacter)和沙雷氏菌 (Serratia)等都在控制植物真菌性病害上具有明顯效果（BashaandUlaganathan. 2002)。
[0003]目前用于生物防治的微生物菌株多數(shù)來自于陸地，而多年來對陸地微生物的篩 選，導(dǎo)致篩選到產(chǎn)生新型抗病機制的微生物越來越少。因而人們逐漸把目光投向了海洋，希 望從海洋環(huán)境中開發(fā)出新型抗病原菌活性物質(zhì)，用于植物病害的生物防治。海洋微生物相 對于陸地微生物而言，一直處于海洋特有的高鹽、高壓、低氧、低光照等極端條件，導(dǎo)致其在 物種、基因組成和生態(tài)功能上的多樣性（李越中，陳琦.1998)。海洋微生物活性物質(zhì)的開 發(fā)利用研究進展迅速，人們已從放線菌、真菌、細菌、微藻等海洋微生物中分離出具有抗腫 瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)功能以及其它用途的生物活性物質(zhì)。
[0004] 據(jù)報道，芽孢桿菌對多種由植物病原真菌所引起的植物病害具有良好的拮抗和 防治效果。在水稻中，由立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani)引起的紋枯病、由稻梨孢 (Magnaporthegrisea)引起的稻痕??；在谷物中，由禾白粉菌（Erysipheraminis)引起 的禾谷類白粉病等；在蔬菜中由灰葡萄孢（Botrytiscinerea)引起的灰霉病、由尖鐮孢菌 (Fusariumoxysporum)引起的枯萎病以及由瓜果腐霉（Pythiumaphanidermatum)引起的 根腐病，等。由此可見，芽孢桿菌是篩選拮抗植物病原真菌生防菌有效來源之一（齊愛勇， 等·2011)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一株芽孢桿菌（Bacillussp. )DY26_004。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種芽孢桿菌（Bacillussp.)DY26-004在制備防治 植物致病真菌發(fā)酵上清液中的應(yīng)用。
[0007] 所述芽孢桿菌（Bacillussp.)DY26-004分離自中國第26次大洋科學(xué)考查所采集 的沉積泥樣品（S003站點；w63° 45. 3496'，S3。39. 8693');該菌已于2015年6月27 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大 學(xué)，郵編430072,保藏中心保藏編號為CCTCCNO:M2015406。
[0008] 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴增DY26-00416SrDNA序列，與美國國家生物技 術(shù)信息中心（NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)其與芽孢桿菌屬(Bacillussp.)具有99%的序列相似性；其16SrDNA序列的GenBank登錄號為KT270352。
[0009] 所述芽孢桿菌（Bacillus sp.)DY26_004的16SrDNA部分序列如下：
[0010]
[0012] 所述芽孢桿菌（Bacillussp.)DY26-004可在制備防治植物致病真菌發(fā)酵上清液 中應(yīng)用。
[0013] 所述防治植物致病真菌發(fā)酵上清液的制備方法如下：
[0014] 將芽孢桿菌（Baci1lussp. )DY26-004放入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，得芽孢桿菌 DY26-004種子液，再接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后離心，除去沉淀菌體，即得 防治植物致病真菌發(fā)酵上清液。
[0015] 所述種子培養(yǎng)基的組成可為：氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， 121°C高滅壓菌20min。
[0016] 所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為：氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，121°C高滅壓菌20min。
[0017] 所述放入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件可在28~30°C，轉(zhuǎn)速180~220r/min下，培養(yǎng) 12 ~24h〇
[0018] 所述接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的芽孢桿菌DY26-004種子液的接入量與液體 發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比可為1 : 1〇〇,所述接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件可為28~ 30°C，轉(zhuǎn)速180~220r/min，培養(yǎng)48~72h。所述離心的條件可在10000r/min下離心 15 ~20min〇
[0019] 所述植物致病真菌包括但不限于鐮刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏擬青霉、核盤菌、長柄 鏈格孢、綠色木霉、立枯絲核菌、互生鏈格孢、灰霉菌、膠孢炭疽菌。在油菜菌核病菌（核盤 菌）和小麥赤霉病（鐮刀菌）防治的盆栽試驗中有較好的生物防治效果，防效分別為65% 和 72%〇
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：芽孢桿菌（Bacillussp.)DY26-004對多 種植物病害的防治有明顯效果，抑真菌譜廣、抑菌效果明顯、發(fā)酵培養(yǎng)基簡單。
【附圖說明】
[0021] 圖1為芽抱桿菌（Bacillussp. )DY26-004的菌落形態(tài)。
[0022] 圖2為芽孢桿菌（Bacillussp.)DY26-004的發(fā)酵上清液對不同植物致病真菌的 抑菌效果圖。在圖2中：A，長柄鏈格孢；B，綠色木霉；C，香蕉炭疽菌；D，核盤菌；E，立枯絲核 菌；F，鐮刀菌；G，宛氏擬青霉；Η:互生鏈格孢；I:鐮刀菌；J:香蕉炭疽菌。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0024] 實施例1 :芽孢桿菌（Bacillussp. )DY26_004的分離篩選
[0025] 本發(fā)明涉及芽孢桿菌（(Bacillussp. )DY26_004由本申請人從中國第26次大洋 科學(xué)考查所采集的沉積泥樣品中所分離獲得，該菌在LB培養(yǎng)基上生長，28°C培養(yǎng)24h后，菌 體呈水滴狀，淺白色，菌落較大，見圖1。
[0026] 實施例2 :芽孢桿菌（Bacillussp. )DY26_004菌種鑒定
[0027]采用16SrRNA基因測序方法對芽孢桿菌DY26-004進行菌種鑒定。利 用通用引物擴增大洋來源菌株DY26-004 16SrDNA序列，正向引物27F序列為： AGAGTTTGATCCTGGCTCAT，反向引物 1492R序列為：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。以芽孢桿菌 DY26-004總DNA為PCR擴增模板，進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 °C變性lmin;55 °C退 火lmin;72°C延長1.5min，30個循環(huán)。擴增基因送測序公司測序，獲得該菌株16SrDNA 序列后，將該序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI)與GeneBank中核酸數(shù)據(jù)進行 對比分析(http: //ncbi.nlm.n