細胞分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
(1)將出生3日齡仔豬，0.1%新潔爾滅全身消毒后，迅速前腔靜脈放血處死，固定仔豬，75%酒精消毒胸腹部皮膚。
[0043](2)無菌手術(shù)刀將仔豬胸部皮膚切開。
[0044](3)無菌剪刀沿最后一根肋骨向前剪開胸腔暴露心臟，無菌剪刀剪開心包膜，取下心臟，立即放入盛有50 mL預(yù)冷PBS燒杯中，洗去血細胞和血凝塊。
[0045](4)無菌鑷子將心臟轉(zhuǎn)移到平皿中，截取心室組織并剝除心肌膜，適量預(yù)冷PBS沖洗，剔除血管、脂肪和結(jié)締組織，漂洗3次。
[0046](5)無菌眼科剪刀將心臟剪成1 mm3左右碎塊，轉(zhuǎn)移到50 mL錐形瓶中，PBS漂洗3次以洗去血細胞，棄掉洗滌液留下組織塊以備消化。
[0047](6)加入0.25%胰蛋白酶和0.1% II型膠原酶1:1混合酶液，用量是組織體積3倍，置37 °(:水浴中振蕩消化15 min后，自然沉淀，吸管吸取棄去上清液。
[0048](7)再加入含DNA酶(終濃度為0.02 mg/mL)的混合酶液，置37 °C水浴中振蕩消化 8 minο
[0049](8)移液管小心吸取上清液移入另一支無菌離心管中，加入10 mL 10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化。如此重復(fù)消化5次。
[0050](9)細胞懸液用100 μ m和40 μ m濾篩分別過濾后收集到離心管，1000 RPM/min離心5 min，加入紅細胞裂解液5 mL, 1000 RPM/min離心5 min棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細胞。
[0051]( 10)得到總細胞懸液均放在冰桶中冷凍保存。
[0052](11)差速貼壁1次90 min,分離純化心肌成纖維細胞。
[0053](12)得到的細胞如圖4~6。
[0054]
實施例3:
一種大白豬心肌成纖維細胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
(1)將出生2日齡仔豬，0.1%新潔爾滅全身消毒，前腔靜脈迅速放血處死，固定仔豬，75%酒精消毒胸腹部皮膚。
[0055](2)無菌的手術(shù)刀將仔豬胸部皮膚切開。
[0056](3)無菌剪刀沿最后一根肋骨向前剪開胸腔，取下心臟，立即放人盛有50 mL預(yù)冷PBS燒杯中，洗去血細胞和血凝塊。
[0057](4)無菌鑷子將心臟轉(zhuǎn)移到無菌平皿中，截取心室組織并剝除心肌膜，適量預(yù)冷PBS沖洗，剔除血管、脂肪和結(jié)締組織，漂洗3次。
[0058](5)無菌眼科剪刀將組織剪成1mm3左右碎塊，轉(zhuǎn)移到50 mL錐形瓶中，PBS漂洗3次，棄掉洗滌液留下組織塊以備消化。
[0059](6)加入0.25%胰蛋白酶和0.1% II型膠原酶1:1混合酶液，用量是組織體積3倍，置37 °(:水浴中振蕩消化15 min后，用吸管吸取上清液。
[0060](7)再加入含DNA酶(終濃度為0.02 mg/mL)的混合酶液，置37 °C水浴中振蕩消化8 min后。
[0061](8)移液管小心吸取上清液移入另一支無菌離心管中，并加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液以終止消化。
[0062](9)用100 μ m和40 μ m濾篩分別過濾后收集到離心管，1000 RPM/min離心5min，加入紅細胞裂解液5 mL, 1000 RPM/min離心5 min棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細胞。
[0063]( 10)收集細胞懸液均放在冰桶中冷凍保存。
[0064](11)連續(xù)差速貼壁2次，每次60 min，分離純化心肌成纖維細胞。
[0065](12)得到的細胞如圖7~9。
[0066](13)如圖7~9，心肌成纖維細胞呈不規(guī)則形或橢圓形，隨后變?yōu)殚L梭形，2~3 d即可呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長。細胞平坦，胞質(zhì)透明，顏色淡，細胞核較大，經(jīng)常含有2~3個核。
[0067](14)通過圖1~3，圖4~6和圖7?9比較，可以看出，按照本發(fā)明方法分離培養(yǎng)的心肌成纖維細胞形態(tài)穩(wěn)定、活性好、數(shù)量足，細胞增殖能力強。
【主權(quán)項】
1.一種豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)心肌組織采樣:無菌條件下取出仔豬心臟，放入盛有50mL預(yù)冷PBS燒杯中； 在無菌操作臺，選取小豬心室，剔除心薄膜組織，用預(yù)冷PBS漂洗多次，把組織剪成蘋果泥狀； 2)心肌組織消化:將剪碎組織轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加入含DNA酶的混合酶液消化； 3)移取上層清液，加入含10%~15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，用100μm和40 μ m濾篩分別過濾，如此重復(fù)，直至組織消化完全； 4)收集細胞懸液后離心棄上清，加入紅細胞裂解液，混勻離心，用含10%~15%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細胞； 5)心肌成纖維細胞培養(yǎng):將得到細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37V、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行差數(shù)貼壁； 6)棄去上層清液，更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.在分離心肌成纖維細胞之前還包括以下前處理步驟: 1)將組織處理器械和玻璃器皿清洗烘干，用牛皮紙包好放入高壓滅菌鍋，121°C滅菌20-30 min ； 2)配制消毒液:取新潔爾滅，用蒸餾水稀釋到終濃度為0.1%后，對仔豬皮膚表面進行消毒。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:消化時，使用0.25%胰蛋白酶和0.1% II型膠原酶1:1混合酶液，用量是心肌組織體積3~5倍。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:加入含DNA酶(0.02 mg/mL) 3-5 mL的消化液消化組織。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:在步驟2)中，終止消化用含10%~15%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液，滴加量為5?15 mL。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:在37°C水浴鍋中消化15 min左右，棄去上次清液，繼續(xù)加入混合消化液消化8~10 min,移取上層清液加入離心管中終止消化，如此重復(fù)3?8次，直到組織塊完全消化為止。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:紅細胞裂解液用量是3~5 mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:收集細胞懸液至于冰上低溫保存。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:差數(shù)貼壁兩次，每次60~90 min,以除去還沒有貼壁的心肌細胞，純化心肌成纖維細胞。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述仔豬心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:培養(yǎng)過程使用含10%~15%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液，每隔2~3天更換培養(yǎng)液。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬心肌成纖維細胞分離方法，屬于現(xiàn)代生物技術(shù)之細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。包括：1）1~3日齡仔豬心臟組織采集，取心室組織剪碎，預(yù)冷PBS漂洗多次。2）心肌組織消化，0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型膠原酶1：1混合37℃多次消化，加入DNA酶（0.02mg/mL）減少細胞懸液粘稠度，提高細胞獲得率，并加入紅細胞裂解液減少紅細胞數(shù)量。3）仔豬心肌成纖維細胞培養(yǎng)，用含10~15%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細胞，差速貼壁得到心肌成纖維細胞。本發(fā)明簡單易掌握，節(jié)約時間，成功率高，獲得的豬心肌成纖維細胞形態(tài)穩(wěn)定、活性好、數(shù)量足。為以后以豬心肌成纖維細胞建立細胞模型研究心臟肥大等相關(guān)疾病奠定一定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105238738
【申請?zhí)枴緾N201510634932
【發(fā)明人】馬瑤, 王宇豪, 肖娟, 王訊, 李明洲
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月30日