抗駝乳重鏈IgG3單克隆抗體、含有所述單克隆抗體的試紙及其應(yīng)用
【專利說明】抗駝乳重鏈lgG3單克隆抗體、含有所述單克隆抗體的試紙 及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以抗體為特征的生物檢測試劑，特別是一種抗駝乳重鏈^心單克隆抗 體，還涉及含有該單克隆抗體的試劑盒及其應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 駱駝是我國邊疆的主要畜種之一，其身處嚴酷環(huán)境經(jīng)長期自然選擇形成了其它畜 種不具備的獨特生物學特性。1993年，HamersCasterman等人發(fā)現(xiàn)在胳盤血清中存在兩種 結(jié)構(gòu)的天然IgG抗體，一種為具有兩條重鏈和兩條輕鏈的常規(guī)四聚體IgGi(約170kD)，另一 種為僅有兩條重鏈構(gòu)成的二聚體抗體，稱為重鏈抗體（heavy-chainantibodies,HCAbs)， 包括IgG2(約100kD)和IgG3 (約90kD)亞型。與一般抗體相比，這些重鏈并不與輕鏈締合， 它們的重鏈可變區(qū)（VHH)與鉸鏈區(qū)間并沒有傳統(tǒng)免疫球蛋白中的第一穩(wěn)定區(qū)（CH1)，可變 區(qū)直接與鉸鏈區(qū)和Fc相連接，重鏈抗體的VHH還具有不同于VH的特征（見圖1)。但是這 種二聚體免疫球蛋白仍能像正?？贵w一樣與抗原等靶標緊緊結(jié)合，而且不像單鏈抗體那樣 相互粘連聚集成塊，因而在駱駝的體液免疫中發(fā)揮非常重要的作用。
[0003] 駱駝是唯一含有重鏈抗體的哺乳動物，這些重鏈抗體盡管缺失輕鏈，但作為抗體 其功能是完整的，這表明重鏈抗體的重鏈可變區(qū)（VHH)單獨能夠形成完整的抗原結(jié)合位 點。重鏈抗體VHH具有分量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、親和力高、人體免疫原型弱、易表達、易純化的優(yōu) 點。
[0004] 駝乳對于大多數(shù)人來說較為陌生，但是對于許多國家來說，駝乳是無可替代的營 養(yǎng)珍品。駝乳不僅富含人體必需的多種氨基酸，還含有溶菌酶、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等保 護性蛋白和多種生物活性因子，可殺菌抑菌、調(diào)節(jié)免疫力，在機體抗病機制方面起著重要作 用。其中免疫球蛋白是駱駝常乳和初乳中最值得關(guān)注的免疫因子，駱駝常乳和初乳中最主 要的免疫球蛋白為IgG，而IgM、IgA含量很少。駝乳IgG包括三個亞類，分別為IgGi、IgG2 和IgG3。在許多國家不僅飲用駝乳攝取營養(yǎng)，還常用駝乳來輔助治療腹瀉、胃潰瘍、糖尿病 等疾病，并取得了良好的成績。因此，近年來駝乳及其制品的開發(fā)和研究逐漸興起。
[0005] 我國是最早馴養(yǎng)雙峰§它的國家之一，也是雙峰§它主要分布區(qū)域之一。但我國§它乳 產(chǎn)業(yè)起步較晚，然而隨著人們對駝乳的認識加深，駝乳的需求量日漸增加，需求量遠大于供 應(yīng)量。由于駝乳不像牛乳那樣容易擠出，而且產(chǎn)量較低，因此一方面限制了駝乳企業(yè)的發(fā) 展，另一方面造成了駝乳摻假現(xiàn)象的發(fā)生。然而，現(xiàn)有技術(shù)中還缺少能夠快速、有效地檢測 駝乳是否摻假的技術(shù)。
[0006] 金標免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標記物或顯色劑應(yīng)用于抗原抗體特異性 免疫反應(yīng)的一種免疫分析技術(shù)，具備操作簡單、特異敏感、可單份測定、成本低、不需要儀器 的特點。金標免疫層析試紙條通常包括樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和底板。 其中，樣品墊置于試紙條的前端，用于進樣；金標結(jié)合墊是膠體金標記過的待測物的受體的 承載體，測試液經(jīng)樣品墊流經(jīng)時，膠體金結(jié)合物從金標結(jié)合墊上釋放并與測試液中的待測 物特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，隨測試液一起流向硝酸纖維素膜；硝酸纖維素膜是金標免 疫層析試紙條的結(jié)果顯示區(qū)域，其一般有兩條線：捕獲線（或稱測試線）和控制線。捕獲線 上包被待測物的另一特異性抗體，而控制線上包抗膠體金標記物中抗體的羊抗鼠IgG，即抗 金標結(jié)合墊上膠體金標記過的受體的抗體；吸收墊通常置于試紙條末端。
[0007] 目前，膠體金免疫層系技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、藥品、生物醫(yī)學等許多領(lǐng)域的檢 測。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明利用駝乳重鏈抗體的特點，從駝乳中獲得重鏈抗體IgG3，以駝乳^心抗體 為免疫原制作小鼠抗駝乳IgG的單克隆抗體，篩選小鼠抗駝乳IgG3單克隆抗體，研制可以 檢測駝乳IgG3抗體水平的試劑盒，為檢測駝乳制品提供快速的檢測方法。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株小鼠骨髓瘤細胞H2H6,所述細胞株于2015 年8月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.11099。
[0010] 本發(fā)明還提供抗駝乳IgG3單克隆抗體IgG，所述單克隆抗體是由前述的小鼠骨髓 瘤細胞產(chǎn)生的。優(yōu)選地，所述單克隆抗體為IgG2b亞類，其價效達1:102400。
[0011] 本發(fā)明還提供所述單克隆抗體在檢測駝乳制品中駝乳含量水平的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供含有駝乳重鏈IgG3抗體的檢測試紙，所述試紙包括樣品墊、金標結(jié) 合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，所述硝酸纖維素膜包被上述的抗駝乳IgG3的單克隆 抗體。
[0013] 在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述抗駝乳IgG3的單克隆抗體由膠體金標記。
[0014] 特別優(yōu)選地，所述檢測試紙采用競爭法制備得到。
[0015] 本發(fā)明首次利用駝乳特異性重鏈抗體作為免疫原制備單克隆抗體，并制作檢測試 劑盒/檢測試紙；通過對比競爭法與夾心法，本發(fā)明的檢測試紙檢測效果好，具有特異性與 靈敏度高、檢測時間短的優(yōu)點；本發(fā)明的試劑價格低廉，實驗操作方便，無需特殊的儀器設(shè) 備，可以滿足有關(guān)研究單位，質(zhì)監(jiān)部門批量檢測相關(guān)乳品質(zhì)量的需要；本發(fā)明的檢測試紙可 用于駝乳及其制品中乳源摻假的快速檢測。
[0016] 本發(fā)明涉及的小鼠骨髓瘤細胞H2H6于2015年8月13日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生 物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 11099 【【附圖說明】】
[0017] 圖1為常規(guī)抗體與駱駝重鏈抗體結(jié)構(gòu)圖，其中A:常規(guī)抗體IgG，B:駱駝重鏈抗體， C:納米抗體（VHH)。
[0018] 圖2為純化駝乳IgG3電泳圖，其中M:marker，1 :駝乳中層澄清液，2 :純化駝乳 IgG3〇
[0019] 圖3為雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的線路流程。
[0020] 圖4為純化抗§它乳IgG3單克隆抗體IgG電泳圖；其中M:marker，1~9 :純化抗馬它 乳IgG3單克隆抗體（1: :H2H6,2 :H11E8,3 :G1C7,4 :F1B3,5 :F11A4,6 :B8F10,7 :B12G11，8 : B5E11,9 ：A12C2)〇
[0021] 圖5為競爭法試紙檢測駝乳以及牛乳；其中1 :檢測駝乳（陽性），2 :檢測牛乳（陰 性）。
[0022] 圖6為競爭法試紙檢測駝乳與牛乳的混合樣品；其中1 :牛乳，2 :駝乳：牛乳= 1:9, 3 :駝乳：牛乳=3:7,4 :駝乳：牛乳=5:5, 5 :駝乳：牛乳=7:3,6 :駝乳：牛乳=9:1， 7 :駝乳。
[0023] 圖7為檢測試紙結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 圖8為檢測試紙使用說明圖。
[0025] 圖9為試紙條檢測結(jié)果說明圖。 【【具體實施方式】】
[0026] 通過以下實施例非限制性地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0027] 實施例1
[0028] 1.駝乳重鏈抗體IgG3純化
[0029] (1)樣品處理：取盤乳化凍，高速低溫離心機12000rpm4°C離心60min，去掉上層 脂肪和下層沉淀；取出中層的液體，取其中不超過〇.lmL用于SDS-PAGE電泳。
[0030] (2)駝乳IgG3分離純化：
[0031] ①取澄清的中層液與PBS按體積比1 :5稀釋；
[0032] ②預(yù)處理ProteinGaogaroseFF柱，用 10mLProteinGaogaroseFF膠裝柱， 用0. 02MpH7. 0的磷酸鹽緩沖液平衡5倍體積；
[0033] ③按其操作步驟上樣，用至少10倍體積的平衡緩沖液清洗柱子，去除雜質(zhì)；
[0034] ④用0. 2MpH3. 6的檸檬酸緩沖液洗脫，收集IgG3洗脫峰，并用1MpH9.OTris-H