抗pr蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗pr單克隆抗體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗PR蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生 的抗PR單克隆抗體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，全球每年有上百萬婦女患乳腺癌，幾十萬人 死于乳腺癌。在西歐、北美等發(fā)達(dá)國家，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位。在我國近年來 乳腺癌發(fā)病率增長趨勢明顯，在一些城市已成為女性惡性腫瘤發(fā)病的首位。乳腺癌已成為 婦女健康的最大威脅。
[0003] 內(nèi)分泌治療是乳腺癌主要治療方法之一，已成為乳腺癌治療的重要組成部分。影 響乳腺癌內(nèi)分泌治療效果的主要因素是雌激素受體（ER)和孕激素受體（PR)的表達(dá)情況。 有學(xué)者統(tǒng)計(jì)，ER+/PR+患者ΤΑΜ治療有效率約60-75%，ER+/PR患者下降至35~50%，并且， 即使是ER/PR患者接受ΤΑΜ治療后仍然有5%的患者可以從中獲益。接受ΤΑΜ治療的ER+/ PR+患者復(fù)發(fā)及死亡相對危險(xiǎn)性與ER+/PR患者相比下降15%~30%，說明PR對內(nèi)分泌治 療效果有較大的影響。
[0004] 孕激素受體（PR)屬于核受體家族轉(zhuǎn)錄因子，通過和孕激素結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化， 與特定靶基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)敏感靶基因的轉(zhuǎn)錄。PR是孕激素作用的 靶點(diǎn)，其可促進(jìn)孕激素刺激激素依賴性乳腺癌細(xì)胞的生長。PR至少包括兩種不同亞型即 94kD的hPR-A和116kD的hPR-B，在正常子宮內(nèi)膜及乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)也在部分乳 腺癌的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，是乳腺癌預(yù)后及激素治療的重要指示因子。同時(shí)，PR也在一些卵 巢癌和子宮內(nèi)膜癌病患腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。
[0005] 目前在臨床上通常用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry,IHC)病理實(shí)驗(yàn)檢測 腫瘤細(xì)胞中PR的表達(dá)狀況；而在科研上則多用蛋白印記和流式細(xì)胞術(shù)等方法來檢測PR的 表達(dá)水平；但這些實(shí)驗(yàn)方法的核心為特異性結(jié)合PR的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定 著整個(gè)檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性較高的針對PR蛋白的單克隆 抗體具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供抗PR蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的 抗PR單克隆抗體和應(yīng)用，提高所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗與PR蛋白的結(jié)合特異性并應(yīng)用 到相關(guān)廣品的制備中。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 抗PR蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，保藏編號為CGMCCNO:11083。
[0009] 本發(fā)明所述抗PR蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞由以下方法制備獲得：
[0010] (1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)PR片段（l-298aa，PR-N298)0RF核苷酸序列 (PR-N2980RF核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，894p;PR-N298氨基酸序列如SEQIDNO. 2 所示）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRI和Bglll，插入 表達(dá)載體pET-23b(貨號Cat.No. 69771-3,Novagen公司），構(gòu)建PR-N298片段重組表達(dá)質(zhì) 粒pET-23b/PR-N298 ;
[0011] (2)PR片段重組蛋白的表達(dá)與純化：將PR片段重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.Coli感受態(tài) 細(xì)胞，挑單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后收獲細(xì)菌，裂解離心取上清，NTA親和層析柱純化，獲 得純化的PR重組蛋白片段；
[0012] (3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的PR重組蛋白片段免疫BALB/c小 鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜 交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗PR特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株；通過無血清培養(yǎng)基制備抗體，通 過親和層析柱純化獲得PR單克隆抗體。分別通過蛋白印記（Western-Blot)、流式細(xì)胞術(shù) (FC)、免疫組化（IHC)檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。
[0013] 經(jīng)過上述方法制備后，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗PR單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名 為UMAB136,亞型鑒定為IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保 藏編號為CGMCCN0 :11083。
[0014] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種抗PR蛋白單克隆抗體，由保藏編號為CGMCCNO:11083的 雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。制備抗PR蛋白單克隆抗體可采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法，如通過無血 清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得PR單克隆抗體。
[0015] 本發(fā)明所述保藏編號為CGMCCNO:11083的雜交瘤細(xì)胞染色體穩(wěn)定，其分泌產(chǎn)生 的抗PR蛋白單克隆抗體為IgG2a型，效價(jià)較高。所述單克隆抗體的免疫組化檢測結(jié)果顯示， 其能夠識別正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中的PR蛋白；在流式細(xì)胞術(shù)檢測中，其能 夠檢測人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中PR蛋白；在蛋白印記檢測中，其能夠檢測到轉(zhuǎn)染PR重組 質(zhì)粒（RC221303)的HEK293T細(xì)胞裂解液以及MCF-7中PR蛋白，分子量大小與預(yù)期相符，而 239T細(xì)胞中則沒有相應(yīng)大小的條帶，表明本發(fā)明所述單抗能檢測到PR蛋白的特異性表達(dá)。
[0016] 同時(shí)，采用OriGene高密度蛋白芯片檢測所述單抗的特異性試驗(yàn)表明，本發(fā)明所 述單克隆抗體與近10000種其他蛋白無交叉反應(yīng)。
[0017] 因此，本發(fā)明還提供了保藏編號為CGMCCNO:11083的的雜交瘤細(xì)胞在制備抗PR 蛋白單克隆抗體中的應(yīng)用以及所分泌的抗PR蛋白單克隆抗體在制備檢測PR蛋白的免疫檢 測產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0018] 作為優(yōu)選，所述免疫檢測產(chǎn)品為試劑盒、試紙或芯片。
[0019] 本發(fā)明還提供一種用于蛋白印記檢測、流式細(xì)胞術(shù)檢測和免疫組化檢測的試劑 盒，包括保藏編號為CGMCCNO:11083的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗PR蛋白單克隆抗體。所 述免疫檢測試劑盒可檢測組織（包括正常組織和腫瘤組織）細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的PR陽性 的腫瘤細(xì)胞系中PR的表達(dá)狀況。
[0020] 此外，本發(fā)明還提供保藏編號為CGMCCNO:11083的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗PR 蛋白單克隆抗體在制備標(biāo)記腫瘤組織的試劑盒中的應(yīng)用。
[0021] 作為優(yōu)選，所述腫瘤包括乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌。
[0022] 本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞可穩(wěn)定分泌產(chǎn)生抗PR蛋白單克隆抗體，且與PR蛋白特 異性結(jié)合，而與蛋白芯片上近10000種其他蛋白無交叉反應(yīng)，顯著提高了PR蛋白免疫檢測 的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性，廣泛適用于各種腫瘤組織特別是乳腺癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌 和宮頸癌等腫瘤組織的檢測和標(biāo)記。
[0023] 生物保藏信息說明
[0024] UMAB136,分類命名為孕激素受體（PR)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，于2015年7月3 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0 :11083。
【附圖說明】
[0025] 圖1所示為實(shí)施例1中PR蛋白Westernblot檢測結(jié)果圖，以anti-His檢測PR 蛋白在E.Coli中的表達(dá)，其中泳道L為轉(zhuǎn)染空載體pET-23b的E.Coli裂解液為抗原的檢 測結(jié)果、泳道R為轉(zhuǎn)染pET-23b/PR-N298質(zhì)粒的E.Coli裂解液抗原的檢測結(jié)果；
[0026] 圖2所示為實(shí)施例2中PR-N298純化蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖；
[0027] 圖3所示為實(shí)施例4中PR蛋白Westernblot檢測結(jié)果圖，以UMAB136分泌產(chǎn)生 PR單克隆抗體（1:2000)檢測陰性對照細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染PR真核表達(dá)質(zhì)粒RC221303的細(xì)胞 裂解液，以及PR陽性的MCF-7細(xì)胞裂解液；
[0028] 圖4所示實(shí)施例5人乳腺癌細(xì)胞系中流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖（一抗為UMAB136分 泌產(chǎn)生PR單克隆抗體）；其中，A信號區(qū)域表示檢測人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中PR蛋白，圖中 B信號代表陰性對照抗體信號；
[0029] 圖5所示實(shí)施例6正常乳腺組織中免疫組化檢測結(jié)果圖（一抗為UMAB136分泌產(chǎn) 生PR單克隆抗體）；
[0030] 圖6所示實(shí)施例6正常子宮內(nèi)膜組織中免疫組化檢測結(jié)果圖（一抗為UMAB136分 泌產(chǎn)生PR單克隆抗體）；
[0031] 圖7所示實(shí)施例6子宮內(nèi)膜癌組織免疫組化檢測結(jié)果圖（一抗為UMAB136分泌產(chǎn) 生PR單克隆抗體，1:150);
[0032] 圖8所示實(shí)施例70rigene蛋白芯片鑒定結(jié)果圖（一抗為UMAB136分泌產(chǎn)生PR單 克隆抗體，1:150 ;二抗為Alexa647-標(biāo)記的驢抗鼠IgG，1:500)。
【具體實(shí)施方式】：
[0033] 本發(fā)明公開了抗PR蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗PR單克隆抗體和 應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所 有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。 本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本 發(fā)明技術(shù)。
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