一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)外植體遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灧椒I(lǐng)域，具體為一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)外植體遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]共培養(yǎng)是植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炥D(zhuǎn)化過程中最為關(guān)鍵的一環(huán)。T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在此時完成。農(nóng)桿菌附著外植體后不能立即轉(zhuǎn)化，附著16h后才能誘發(fā)腫瘤經(jīng)過“細(xì)胞調(diào)節(jié)期”，使T-DNA發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此共培養(yǎng)時間較長。但共培養(yǎng)時間過長，也可能導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度增殖使植物細(xì)胞受到毒害而死亡。共培養(yǎng)中農(nóng)桿菌的增殖速度直接與轉(zhuǎn)化有關(guān)，農(nóng)桿菌增殖和生長狀態(tài)與其侵染能力相關(guān)。
[0003]農(nóng)桿菌培養(yǎng)大多直接將外植體放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由于常使用的培養(yǎng)基加入了大量元素、微量元素、蔗糖等物質(zhì)(常用共培養(yǎng)基成份為:MS (大量，微量，有機，肌醇)+ 3%(W/V)蔗糖+ 200uM AS + 0.7% (W/V)瓊脂粉)，一是比較容易染菌；二是由于培養(yǎng)基含水量高，而且沒有濾紙，容易造成農(nóng)桿菌過度生長，導(dǎo)致后期由于無法抑制過多農(nóng)桿菌的生長使外植體褐化而死。根癌農(nóng)桿菌侵染外植體時，既要使菌液和外植體充分接觸，T-DNA能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，又不能使外植體受到農(nóng)桿菌毒害過大，導(dǎo)致后期由于無法抑制過多農(nóng)桿菌的生長使外植體褐化而死。現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)過程中大多因共培養(yǎng)過程操作不當(dāng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低下甚至后續(xù)實驗無法進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)外植體遺傳轉(zhuǎn)化方法可以保證外植體在共培養(yǎng)時間段內(nèi)既不因失水而失去活力，也能保證農(nóng)桿菌不過多的增殖。
[0005]—種農(nóng)桿菌介導(dǎo)外植體遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括:1)農(nóng)桿菌的活化、2)農(nóng)桿菌侵染外植體、3)農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)、4)外植體誘導(dǎo)和篩選分化，所述農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)步驟的操作為:在固體共培養(yǎng)基上放置滅菌濾紙將農(nóng)桿菌侵染后的外植體表面菌液吸凈后放置在所述滅菌濾紙上黑暗條件培養(yǎng)3~4天，培養(yǎng)溫度22~23°C。
[0006]進(jìn)一步的，所述固體共培養(yǎng)基的制備方法為:蒸餾水加入0.7% (W/V)的瓊脂粉，高壓滅菌后加入200uM乙酰丁香酮。
[0007]進(jìn)一步的，所述濾紙為Whatman N0.1定性濾紙。
[0008]進(jìn)一步的，所述農(nóng)桿菌活化的具體操作為:取凍存農(nóng)桿菌，在冰上融化后接種于5ml YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm過夜振蕩培養(yǎng)；次日擴(kuò)大培養(yǎng)于50ml的YEP液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D_=0.6-0.8，離心收集菌體，重懸于侵染培養(yǎng)液中，侵染前加入200 μ Μ乙酰丁香酮，得活化的農(nóng)桿菌懸液。
[0009]進(jìn)一步的，所述農(nóng)桿菌侵染外植體的具體操作為:外植體與活化的農(nóng)桿菌懸液混合，浸染時間為10~30min。
[0010]進(jìn)一步的，所述外植體誘導(dǎo)和篩選分化過程的具體操作為:經(jīng)過共培養(yǎng)后的外植體用附加200~300mg/L Timentin的無菌水清洗后，以無菌濾紙吸去殘留液體，于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)5-7天，轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待抗性芽長至l_2cm時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上生根，所述分化培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的條件:溫度25°C，光照14h/d，光照強度
1600~20001uxo
[0011]進(jìn)一步的，所述外植體誘導(dǎo)和篩選分化過程的具體操作為:經(jīng)過共培養(yǎng)后的外植體用附加250mg/L Timentin的無菌水洗3_4遍，再用無菌濾紙吸去殘留液體，于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3-4周，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待抗性芽長至l-2cm時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上生根，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的條件:溫度25°C，光照16h/d，光照強度
1600~20001uxo
[0012]進(jìn)一步的，所述外植體為葉片、葉柄、莖、幼胚、成熟胚。
[0013]進(jìn)一步的，所述農(nóng)桿菌菌株為EHA105、LBA4404、GV3101、AGL1。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
1)培養(yǎng)基的滲透一直可以保持濕潤狀態(tài)，這樣既可以保證外植體在共培養(yǎng)時間段內(nèi)不因失水而失去活力，也能保證農(nóng)桿菌不過多的生長，使外植體和農(nóng)桿菌充分接觸而不過度生長，從而可以提高轉(zhuǎn)化效率。
[0015]2)簡化共培養(yǎng)基配制，采用最簡單的培養(yǎng)成分滿足轉(zhuǎn)化的需要，即能保證培養(yǎng)基的濕潤度又可以減少共培養(yǎng)過程中的污染。
[0016]下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0017]圖1為兩種共培養(yǎng)方式瞬時表達(dá)結(jié)果比較。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)外植體遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括:1)農(nóng)桿菌的活化、2)農(nóng)桿菌侵染外植體和3)農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)、4)外植體誘導(dǎo)和篩選分化，所述農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)步驟的操作為:在固體共培養(yǎng)基上放置滅菌Whatman N0.1濾紙，將農(nóng)桿菌侵染后的外植體表面菌液吸凈后放置在所述滅菌濾紙上，22-23°C，黑暗狀態(tài)下培養(yǎng)3~4天。
[0019]所述固體共培養(yǎng)基的制備方法為:蒸餾水加入0.7% (W/V)的瓊脂粉。高壓滅菌后加入200uM AS (乙酰丁香酮)。
[0020]Whatman定性濾紙用于定性分析技術(shù)中鑒定物質(zhì)的性質(zhì)。折疊好的定性濾紙與相同型號平整的濾紙相比，加快了流速和增加了負(fù)載力。
[0021]所述農(nóng)桿菌活化的具體操作為:取凍存農(nóng)桿菌，在冰上融化后接種于5ml YEP液體培養(yǎng)基中，28 °C，200rpm過夜振蕩培養(yǎng)；次日擴(kuò)大培養(yǎng)于50ml的YEP液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D6QQ=0.6-0.8，離心收集菌體，重懸于侵染培養(yǎng)液中，侵染前加入200 μ Μ乙酰丁香酮，得活化的農(nóng)桿菌懸液。
[0022]所述農(nóng)桿菌侵染外植體的具體操作為:外植體與活化的農(nóng)桿菌懸液混合，室溫下，浸染時間為10~30min。
[0023]對楊樹葉片等外植體誘導(dǎo)和篩選分化的具體操作為:經(jīng)過共培養(yǎng)后的外植體用附加200~300mg/L Timentin的無菌水清洗后，以無菌濾紙吸去殘留液體，于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)5-7天，轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待抗性芽長至l_2cm時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上生根。分化、選擇、生根培養(yǎng)條件:溫度25°C，光照14h/d，光照強度1600~20001ux。
[0024]對于小麥胚等外植體誘導(dǎo)和篩選分化過程的具體操作為:經(jīng)過共培養(yǎng)后的外植體用附加250mg/L Timentin的無菌水洗3_4遍，再用無菌濾紙吸去殘留液體，于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3-4周，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待抗性芽長至l-2cm時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上生根，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的條件:溫度25°C，光照16h/d，光照強度
1600~20001uxo
[0025]所述外植體葉片、葉柄、莖、幼胚、成熟胚。所述農(nóng)桿菌菌株EHA105，LBA4404，GV3101、AGLlo
[0026]本實施例中采用簡化的固體培養(yǎng)基與無菌濾紙相結(jié)合的技術(shù)方案來進(jìn)行農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)操作，在現(xiàn)有技術(shù)中農(nóng)桿菌培養(yǎng)大多直接將外植體放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由于常使用的培養(yǎng)基加入了大量元素、微量元素、蔗糖等物質(zhì)(常用共培養(yǎng)基成份為:MS(大量，微量，有機，肌醇)+3% (W/V)蔗糖+ 0.7% (W/V)瓊脂粉+ 200uM AS)，一是比較容易染菌；二是由于培養(yǎng)基含水量高，而且沒有濾紙，容易造成農(nóng)桿菌過度生長，導(dǎo)致后期由于無法抑制過多農(nóng)桿菌的生長使外植體褐化而死。
[0027]也有些現(xiàn)有技術(shù)中將濾紙直接放在無菌培養(yǎng)皿中，在濾紙上加入無菌水，然后將外植體直接放入其中培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程中沒有使用培養(yǎng)基。本發(fā)明的研究過程中發(fā)現(xiàn)，上述操作比較適合愈傷組織的培養(yǎng)，在外植體共培養(yǎng)中使用上述方法培養(yǎng)過程容易缺水，不能保證長時間的適度濕潤，只有如本實施例中將簡化培養(yǎng)基于濾紙結(jié)合才能保證最佳的濕潤度，且不易污染。
[0028]實施例2
本實施例是在實施例1的基礎(chǔ)上進(jìn)行的具體的改進(jìn)一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)外植體遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括:
1)農(nóng)桿菌的活化:
菌株為農(nóng)桿菌EHA105 (PCAMBIA3301)。從_80°C冰箱中取出農(nóng)桿菌，在冰上融化后接種于5ml YEP (添加50mg/L利福平(Rif )、5mg/L四環(huán)素(Tet)和50 mg/L卡那霉素(Km))液體培養(yǎng)基中，28 °C，200rpm過夜振蕩培養(yǎng)；次日擴(kuò)大培養(yǎng)于50ml的YEP液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D6QQ=0.6-