后，再放入液氮瓶口位置2h，最后放入液氮瓶中進(jìn)行 凍存。
[0040] 實(shí)施例4 :泥螺寡肽抗前列腺癌DU-145細(xì)胞活性試驗(yàn)
[0041] (4. 1)對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制的影響
[0042] 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，設(shè)5個(gè)平行孔，于 5%C02,37°C貼壁16-48h，倒置顯微鏡下觀察，棄去培養(yǎng)液，同時(shí)將泥螺酶解液以不同濃度 分別溶于培養(yǎng)液中。然后分別加入每個(gè)孔，同時(shí)設(shè)不加樣品的對(duì)照組，置5%C02,37°C培養(yǎng) 箱中孵育36h，用PBS沖洗2遍，加入含有MTT的營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去 孔內(nèi)培養(yǎng)液。加入二甲基亞楓，置搖床上低速振蕩lOmin，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490nm測(cè) 吸光度值（0D值）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)（IR，Inhibitionrate)，即增殖抑制率，按下列 公式計(jì)算：
[0043]
[0044] 將實(shí)施例1中制得的泥螺寡肽設(shè)置為5個(gè)濃度組，分別為6mg/mL、8mg/mL、10mg/ mL、12mg/mL和14mg/mL。作用24、36小時(shí)后，對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行MTT檢測(cè)。結(jié) 果表明：作用36h后，泥螺寡肽對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到88. 4%，如表1所示，并且， 對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率與泥螺寡肽的濃度以及作用時(shí)間分別正相關(guān)，如圖3、圖4所示。
[0045] 表1泥螺寡肽對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率（X±s)(η= 3)
[0046]
[0047] 注：*與每個(gè)組分的最小的細(xì)胞抑制率相比，P〈0. 05
[0048] (4. 2)對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡的影響
[0049] (4. 2.1)HE染色
[0050] 蓋玻片經(jīng)過多聚賴氨酸酸化24h,自來水沖洗20遍，蒸饋水浸泡24h,干燥后高壓 滅菌等方法處理，小心的平鋪在六孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)瓶中的癌細(xì)胞〇. 25%的消化液進(jìn)行 消化，待細(xì)胞間隙明顯且變圓變亮?xí)r，吸掉消化液，營養(yǎng)液加入10%胎牛血清，用滴管反復(fù) 吹打至單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)為1X1〇5·mL1左右。小心的接種到蓋玻片上，每 孔滴加2mL左右，然后放入到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待蓋玻片上的細(xì)胞長滿80%左右，加入用 營養(yǎng)液配好的不同濃度藥物組和對(duì)照組進(jìn)行培養(yǎng)。
[0051] 細(xì)胞爬片結(jié)束后，小心的將蓋玻片取出，輕輕的用PBS洗2次，每次lmin左右，然 后95%酒精固定15111；[11，輕輕的用？135洗3次，每次3111；[11。加入蘇木素染色8111；[11，自來水浸 洗30s，鹽酸酒精分化，自來水浸洗。當(dāng)細(xì)胞核變藍(lán)時(shí)，再加入伊紅染液復(fù)染30s，自來水浸 洗。分別用50%、75%、95%和無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，每次5min，共3次。用中性 樹脂將染好色的玻片進(jìn)行封片，有細(xì)胞的一面一定要向下貼合在載玻片上。在光學(xué)顯微鏡 下觀察形態(tài)并攝片。
[0052] 如圖5所示，正常的DU-145細(xì)胞的對(duì)照組A圖，觀察到細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則飽滿，細(xì) 胞質(zhì)染色分布較為均勻，核仁數(shù)目較多。B圖為6mg/mL濃度下形態(tài)，特征有細(xì)胞外形改變， 細(xì)胞膜變得不規(guī)則，細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)輕度集中現(xiàn)象。C圖為10mg/mL藥物濃度下的 細(xì)胞，出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞膜較B圖進(jìn)一步變得不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)染 色呈凝塊狀，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的小體現(xiàn)狀；D圖為14mg/mL藥物濃度下的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞出現(xiàn) 明顯的凋亡特點(diǎn)，出現(xiàn)細(xì)胞不規(guī)則、胞膜脫落等特征?？梢?，泥螺寡肽作用24h后，隨著藥物 劑量的逐漸增加，對(duì)DU-145細(xì)胞的抑制現(xiàn)象較為明顯，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞核核仁的數(shù)目逐 漸減少，細(xì)胞核顏色逐漸變深，細(xì)胞膜脫落，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞的體積逐漸變小，細(xì)胞的形態(tài)變 化尤為明顯。
[0053] (4· 2· 2)A0/EB熒光染色
[0054] 取對(duì)數(shù)生長期的前列腺癌DU-145腫瘤細(xì)胞，加入適量胰酶進(jìn)行消化，用含10%的 胎牛血清培養(yǎng)液配成懸液，把蓋玻片平鋪到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，向每孔加入細(xì)胞懸液2mL， 將細(xì)胞板放在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿玻片的80%左右后取出。將藥 液分別加入各孔中，再將細(xì)胞板放到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板。取出載玻 片，加1滴混合熒光染色液：1〇〇μg/mL吖啶橙（A0)、100μg/mL嗅乙啶（EB)混勻，滴在載 玻片上，將爬滿細(xì)胞的蓋玻片壓上，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。
[0055] 熒光染色法是根據(jù)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜完整性不同，使吖啶橙（A0)和溴乙啶 (EB)混合染料染成不同顏色，來區(qū)別細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。圖6為DU-145細(xì)胞在不同藥物濃 度下的效果，其中A圖為正常細(xì)胞，在熒光顯微鏡下無明顯凋亡細(xì)胞，細(xì)胞大小、分布都很 均勻。B圖為細(xì)胞在低濃度藥物（6mg/mL)的作用下的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞膜較為完整但出現(xiàn)空 泡；C圖是在中濃度（10mg/mL)的藥物影響下的細(xì)胞，細(xì)胞核為A0染色呈黃綠色熒光，濃聚 成顆粒狀，位于細(xì)胞的一側(cè)，早期凋亡細(xì)胞開始增加；D圖為高濃度（14mg/mL)下，隨著藥物 濃度的增加，晚期凋亡細(xì)胞增多，核染色質(zhì)發(fā)橙紅色熒光。
[0056] (4. 2. 3)FCM分析細(xì)胞凋亡
[0057] 將培養(yǎng)好的DU-145細(xì)胞用0. 25%胰酶/0. 02%EDTA混合液進(jìn)行消化，消化好的 細(xì)胞用PBS清洗1-2次，胰酶消化時(shí)間不要過長，以免引起假陽性。把消化好的細(xì)胞吸入離 心管中，在4-6°C下離心（1200r/min)5min，吸去上清液，加入400ul的結(jié)合液，輕輕的反復(fù) 吹打使細(xì)胞成為單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1X106cells/mL左右，在細(xì)胞懸浮液中加入5ul的 FITC染色液混勻，在4-6°C下進(jìn)行避光孵育15min，然后加入10ul的PI染液，輕輕混勻在 4-6°C下孵育5min，將處理完的細(xì)胞立即放入FACS進(jìn)行檢測(cè)。
[0058] 流式細(xì)胞術(shù)（FCM)可以將樣品中正常、壞死和凋亡細(xì)胞等分開。如圖7所示，A-1、 A-2、A-3、A-4各圖譜中細(xì)胞分為四個(gè)區(qū)：左上象限代表的是機(jī)械損傷細(xì)胞；左下象限代表 的是正常細(xì)胞；右上象限為晚期凋亡或壞死的細(xì)胞；右下象限代表的是早期凋亡細(xì)胞?？?見隨著多肽濃度的增加，DU-145細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡也在逐漸增大，當(dāng)泥螺寡肽濃 度為14mg/mL時(shí)，早凋?yàn)?2. 27%，晚凋?yàn)?0. 66%。
[0059] 以上各實(shí)施例中使用的主要儀器和材料如下：
[0060] 主要儀器
[0061] 超凈臺(tái)ZHJM-C12090,上海智城分析儀器制造有限公司；
[0062] Forma3111細(xì)胞培養(yǎng)箱，杭州寶城生物科技有限公司；
[0063] 酶標(biāo)儀（美國BI0-RAD);杭州寶城生物科技有限公司；
[0064] FACSCalbur流式細(xì)胞儀，BD公司；
[0065] OLYMPUSCKX41倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS公司；
[0066] 伯樂680酶標(biāo)儀（美國），杭州寶城生物科技有限公司；
[0067] OLYMPUS顯微鏡 500 萬像素Pro-MicroScanCCD，日本OLYMPUS公司；
[0068] 試劑
[0069] 牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；
[0070] MTT(美國SIGMA公司）；
[0071] F12粉末培養(yǎng)基（美國SIGMA公司）；
[0072] RPMI1640 培養(yǎng)基，Gibco公司；
[0073] DMS0 ;(美國SIGMA公司）
[0074] Α0/ΕΒ染色料，昊天生物技術(shù)有限公司
[0075] AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒；貝博生物公司
[0076] 青霉素、鏈霉素；魯抗醫(yī)藥股份有限公司
[0077] 細(xì)胞株
[0078] 人前列腺癌細(xì)胞DU-145購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞庫。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種泥螺寡肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的泥螺寡肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在 于：所述泥螺寡肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述。3. 如權(quán)利要求2所述的泥螺寡肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在 于所述泥螺寡肽通過以下步驟制得：新鮮泥螺洗凈去殼，取泥螺組織搗碎，加入蒸餾水勻 楽，料液比為1: (3~4)，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液將勻漿液的pH值調(diào)節(jié)為8~9,加入 0. 4~0. 5%勻漿液體積的胰蛋白酶，40~50°C保溫水解7~9h，水解完成后95~KKTC、 10~15min進(jìn)行滅酶，4°C下水解液于9500~10000r/min離心15~20min，取上清液，經(jīng) 3kd超濾膜超濾獲得分子量小于3kd的第一組分，將該第一組分經(jīng)凝膠層析洗脫獲得第二 組分，最后將該第二組分反相高效液相色譜分離獲得所述泥螺寡肽。4. 如權(quán)利要求3所述的泥螺寡肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在 于：所述凝膠層析條件如下：所述第一組分的濃度為48~50mg/mL、上樣量為3~4mL、速度 為2. 5~3. 5ml/min，流動(dòng)相為超純水，280nm紫外檢測(cè)。5. 如權(quán)利要求3所述的泥螺寡肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在 于：所述反相高效液相條件如下：選用Zorbax SB-C18(4.6X250,5um);柱溫為20°C ;流動(dòng) 相為1 % TFA和乙腈；梯度洗脫：從開始到30min結(jié)束，乙腈濃度從0變化到40%，洗脫速度 為1.0 mL/min ;進(jìn)樣體積為50ul紫外檢測(cè)波長分別為214nm、280nm。6. 如權(quán)利要求1~5中任一權(quán)利要求所述的泥螺寡肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞藥物 中的應(yīng)用，其特征在于：6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于DU-145細(xì)胞24~36h后，對(duì)前 列腺癌DU-145細(xì)胞的增殖抑制率為33. 5~88. 4%，且增殖抑制率與泥螺寡肽的濃度呈正 相關(guān)。7. 如權(quán)利要求1~5中任一權(quán)利要求所述的泥螺寡肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞藥物 中的應(yīng)用，其特征在于：6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于DU-145細(xì)胞24h后，對(duì)前列腺癌 DU-145細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為20~22. 27%和28~30. 66%，且增殖 抑制率與泥螺寡肽的濃度呈正相關(guān)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種泥螺寡肽在抗前列腺癌中的應(yīng)用，尤其涉及該泥螺寡肽在抗前列腺癌DH-145腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。該泥螺寡肽的氨基酸序列為Gln-Pro-Pro-Gly-Leu，以泥螺為原料，通過胰蛋白酶酶解泥螺組織，結(jié)合凝膠層析和高效液相色譜分離純化獲得。本發(fā)明中的泥螺寡糖可對(duì)前列腺癌DH-145腫瘤細(xì)胞顯著抑制，其中對(duì)DH-145細(xì)胞的增殖抑制率可達(dá)33.5～88.4％，對(duì)前列腺癌DH-145細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為20～22.27％和28～30.66％，可見具有顯著地抗腫瘤活性。泥螺寡肽具有良好的開發(fā)前景，對(duì)泥螺寡糖的抗前列腺癌DH-145腫瘤細(xì)胞的研究可為抗前列腺癌藥物的開發(fā)研究提供理論支持。
【IPC分類】C07K1/16, C12P21/06, A61K38/17, C07K1/20, C07K1/34, C07K14/435, A61P35/00, C07K1/36
【公開號(hào)】CN105238833
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410277152
【發(fā)明人】聞?wù)? 馬劍茵, 曹玉昊, 林煥樂, 胡俊峰
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2014年6月20日