蛋白。
[0049] 實(shí)施例1_2 :纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和0RF2的融合表達(dá)以及分析
[0050] 當(dāng)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)表達(dá)為與不同蛋白的融合蛋白時(shí)，可在細(xì)胞中形成不 溶的顆粒是已知的。因此，在具有與病毒樣顆粒類似的功能的預(yù)期下，嘗試了CBD和0RF2的 融合表達(dá)。在下面兩種情況中，嘗試了與CBD的融合表達(dá)：其中α-淀粉酶信號序列用于細(xì) 胞外分泌（SS-CBD)的情況；和，其中沒有使用α-淀粉酶信號序列的情況。在此，0RF2基 因不含有核定位信號（NLS)。擴(kuò)增CBD和0RF2中的每一個(gè)，然后通過重疊PCR連接擴(kuò)增產(chǎn) 物，并且將其插入到Y(jié)EGa-HIR525的EcoRI和Sail位點(diǎn)中。所使用的引物示于下面的表3 中，并且按照上述方法將構(gòu)建的質(zhì)粒（圖4)轉(zhuǎn)化到Y(jié)2805中。
[0051]表 3
[0052]
[0053] 將包含GAL10啟動子的質(zhì)粒接種在YP(1%Glu和1%Gal)培養(yǎng)基中，并且將包括 ADH1啟動子的質(zhì)粒接種在YP(2%Glu)培養(yǎng)基中，然后在30°C培養(yǎng)48小時(shí)。在包括信號序 列的Y2805的情況中，通過蛋白印跡分析來分析無細(xì)胞提取物和上清液。所使用的抗體是 抗His標(biāo)簽的抗體。在存在信號序列的情況中，可以看到在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外都沒有觀察到 表達(dá)，這暗示基因僅在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（圖5)。在不存在信號序列的情況中，同時(shí)觀察到GAL10 啟動子的表達(dá)和ADH1啟動子的表達(dá)，但示出GAL10啟動子更適于在酵母中表達(dá)。
[0054] 實(shí)施例1-3 :觀察通過在酉良酒酉孝母Saccharomycescerevisiae菌株中表達(dá)的0RF2 形成病毒樣顆粒
[0055] 在以各種方式制備的0RF2表達(dá)盒中，基于蛋白印跡選擇出三株示出有效表 達(dá)0RF2的酵母菌株。此外，根據(jù)實(shí)施例1-1的方法制備僅表達(dá)0RF2的無His標(biāo)簽 的PGAL10-0RF2質(zhì)粒，從而制備了 下面四種質(zhì)粒：pGAL10-0RF2、pGAL10-0RF2-His、 pGAL10-Tyl-0RF2(-NLS)和pGAL-CBD-0RF2(-NLS)-His。將具有每一種質(zhì)粒的Y2805 都以 30°C和180rpm的條件在YPDG中培養(yǎng)48小時(shí)。每一種培養(yǎng)物都在13,OOOrpm離心10分鐘 來收集細(xì)胞。向細(xì)胞中添加TEN緩沖液（10mMTris-HClpH7. 4、2mMEDTA、140mMNaCl) 和珠子，然后渦旋約10分鐘以裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解液在13, 000和4°C下離心20分鐘以收 集上清液，然后收集的上清液進(jìn)行超速離心。通過超速離心，制得在TEN緩沖液中的15%、 25 %、35 %、45 %和60 %的蔗糖溶液，并且順序地倒在離心管中以形成蔗糖梯度。將如上所 述制備的無細(xì)胞提取物添加到離心管的頂部并且在36,OOOrpm離心4小時(shí)。梯度從管的底 部開始分成1. 5-ml的等分，然后進(jìn)行蛋白印跡分析。通過蛋白印跡，收集僅示出0RF2條帶 的組分，使用超濾離心管（Amiconultracentrifugalfilter，Millipore，10K膜）從該組 分中去除蔗糖，之后濃縮該組分并且使用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。在僅表達(dá)0RF2的情況中， 觀察到形成了具有約25nm大小的病毒樣顆粒（圖6)。但是，在存在His標(biāo)簽的情況中，沒 有形成病毒樣顆粒，表明與C-末端結(jié)合的His標(biāo)簽會干擾病毒樣顆粒的形成。此外，示出 預(yù)期輔助病毒樣顆粒形成的Tyl略微干擾病毒樣顆粒的形成。在0RF2表達(dá)為與CBD的融 合蛋白的情況中，觀察到盡管存在His標(biāo)簽，但很好地形成了病毒樣顆粒。
[0056] 實(shí)施例2 :0RF2的分泌表汰和分析
[0057] 重組亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于，如果其細(xì)胞外的分泌表達(dá)可能的話，則省略了對細(xì) 胞裂解的需求并且容易純化。通常來講，除了幾種其它優(yōu)點(diǎn)（諸如安全性）之外，與大腸桿 菌不同，酵母因?yàn)樾纬闪似涞鞍追置跈C(jī)制而適于進(jìn)行分泌表達(dá)。因此，嘗試在酵母中進(jìn)行 0RF2的分泌表達(dá)。
[0058] 當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)全長基因時(shí)，其表達(dá)水平非常低。但是，報(bào)道了：基于位于 氨基末端的NLS區(qū)域的47-氨基酸序列對于構(gòu)象表位的形成并不是必需的這一事實(shí)，表 達(dá)無NLS的克隆來增加其表達(dá)水平。對于0RF2的分泌，使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisia^的交配因子a(matingfactoralpha，MFa)的信號序列。構(gòu)建了表達(dá)0RF2的 全長序列和0RF2的無NLS的序列的載體。所使用的引物示于下面的表4中。使用針對酵 母密碼子進(jìn)行最優(yōu)化的合成序列作為模板，通過PCR擴(kuò)增基因。使用Xbal和Sail消化擴(kuò) 增產(chǎn)物，并且插入到Y(jié)EGa-HIR525的Xbal和Sail位點(diǎn)中。構(gòu)建的載體的示意圖示于圖7 中。使用鋰/醋酸鹽方法，將每一種載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母SaccharomycescerevisiafY2805 中。將酵母細(xì)胞培養(yǎng)在UD(6. 7g/L酵母氮源、0. 77g/L缺尿嘧啶補(bǔ)充物和20g/L葡萄糖） 上，然后通過PCR對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選。
[0059]表 4
[0060]
[0061] 將細(xì)胞在UD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后在YP(1%Glu和1% Gal)培養(yǎng)基中 培養(yǎng)48小時(shí)并且使用抗His抗體進(jìn)行蛋白印跡分析。在存在MFa分泌信號的情況中，不 管是否存在NLS(圖8)，0RF2都既不被分泌到培養(yǎng)基中也不在細(xì)胞中表達(dá)。此外，在不存在 NLS的情況中，顯著增加了 0RF2的表達(dá)水平。
[0062] 實(shí)施例3 :選擇用于在酉良酒酉孝母Saccharomyces cerevisiae菌株中表達(dá)0RF2的 菌株
[0063] 使用在實(shí)施例1-1中觀察到示出高表達(dá)水平的GAL10啟動子，將0RF2引入到經(jīng)常 用于重組表達(dá)的多種釀酒酵母Saccharomycescerevisia^iSf株中，并且對比菌株之間的 0RF2的表達(dá)水平。作為表達(dá)載體，使用實(shí)施例1-3中構(gòu)建的pGAL10-0RF2。用于與釀酒酵母 Saccharomycescerevisia互Y2805進(jìn)行對比的菌株是INVScl、ATCC200589、BY4741、L3262、 ATCC201228和ATCC201741。以與上面所述相同的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)過程，并且通過蛋 白印跡分析對同量的樣品進(jìn)行分析。分析結(jié)果示于圖9中。使用光密度1D程序（UVIBand Max)比較分析0RF2的表達(dá)水平。0RF2沒有在ATCC200589菌株中表達(dá)，而且在ATCC201228 中的表達(dá)也不顯著。此外，當(dāng)0RF2在Y2805菌株中的表達(dá)水平被看作100時(shí)，0RF2在剩余 菌株中的表達(dá)水平在INVScl中為19. 7%，在BY4741中為15. 0%，在L3262中為40. 0%， 且在ATCC201741中為20. 4%。如上所述，可以看到0RF2的表達(dá)水平在菌株之間是顯著不 同的，并且在Y2805菌株中最高。
[0064] 在上述實(shí)施例中觀察到高表達(dá)水平的GAL10啟動子的情況中，為了半乳糖 誘導(dǎo)的啟動子的優(yōu)化表達(dá)，應(yīng)當(dāng)滿足培養(yǎng)基中不存在葡萄糖但存在半乳糖。但是， 與葡萄糖相比，半乳糖是非常昂貴的碳源。本發(fā)明人之前開發(fā)了甚至當(dāng)僅使用葡 萄糖而不添加昂貴的半乳糖時(shí)，也能使用缺乏gal 80的釀酒酵母Saccharomyces cerevisia互菌株經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)重組蛋白的方法（韓國專利號10-0947376 (2010年3 月5日），題目為"一種使用缺乏GAL80的酵母菌株生產(chǎn)重組蛋白的方法（ GAL80 平暑叫普fi刈王釷珪嗎省糾吻灶噴嗜）"）。
[0065] 為了檢驗(yàn)0RF2在缺乏gal80的菌株中的表達(dá)模式，使用鋰/醋酸鹽方法將在 實(shí)施例1-3中構(gòu)建的PGAL10-0RF2轉(zhuǎn)化到以下菌株中：如上所述示出最高表達(dá)水平的釀 酒酵母Saccharomycescerevisia^YSSOSAgal80,不出低表達(dá)水平的BY4741，和BY4741 Δgal80。將菌株培養(yǎng)在UD(6. 7g/L酵母氮源、0. 77g/L缺尿嘧啶補(bǔ)充物和20g/L葡萄糖） 平板上，然后通過PCR對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選。在酵母的情況中，將單個(gè)酵母菌落接種在2ml的 UD液體培養(yǎng)基中，在30°C和180rpm下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后進(jìn)行主培養(yǎng)。對于主培養(yǎng)，在Y2805 和BY4741的情況中，將25mlYP(l%Glul和l%Gal)培養(yǎng)基（2%蛋白胨、1%酵母提取物、 1%葡萄糖和1%半乳糖）添加到250ml折流瓶中，在Y2805Aga180和BY4741Aga180的 情況中，將25mlYP(2%Glu)添加到250ml折流瓶中，然后將每一種初始培養(yǎng)的菌株接種到 培養(yǎng)基中直至〇D6。。達(dá)到0. 1。接種的菌株在30°C和180rpm下震蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)的 菌株以與上述相同的方式進(jìn)行蛋白印跡分析，分析結(jié)果示于圖10中?？梢杂^察到，0RF2在 四種菌株中都表達(dá)，但是0RF