4h和48h的LA處理誘導SSG3細胞中FADS2表達的顯著增加。*p-值〈0. 05 (配 對的2-尾的Student氏t檢驗）。（f)Δ6去飽和酶/FADS2催化棕櫚酸向順-6-十六碳烯 酸的轉化。（g)脂質分析顯示NIKS和SSG3沉淀中Δ9和Δ6的百分率和Δ6/Δ9比。（h) 順-6-十六碳烯酸（*)可在SSG3中檢測為體內皮脂，然而在NIKS中，棕櫚油酸（**)是檢 測的豐富的脂質。
[0106] 圖3.TGF0信號傳導是在皮脂腺中體內和體外有活性的。將皮脂腺以水平面切 片（圖中的紅線）。（a)用TGFi3RII染色的人頭皮組織的0CT切片（紅色，由白色箭標顯 示）顯示皮脂腺全體中受體的表達，除了中央處分化的細胞之外。放大框住的區(qū)及顯示于 (a'）。（b)TGFβ通路是體內有活性的，如通過核磷酸化的Smad2的表達表示（紅色，由白 色箭標顯示）。α6:α6_整聯(lián)蛋白將皮脂腺的基底層染成綠色，由白色箭標顯示。比例尺， 50ym(a)，20ym(a'，b，b'）?？s寫：Epi，表皮；HF，毛囊；SG，皮脂腺。（c)指示的皮脂細胞 培養(yǎng)用5ng/ml的TGFi3 1配體處理1小時，和由免疫印跡檢查全細胞提取物，以測定TGF0 通路的活化。
[0107] 圖4.TGF0信號傳導通過TGFi3RII-Smad2依賴性通路引發(fā)脂原性基因降低的表 達。（a,b)將SSG3細胞用5ng/ml的TGFβ1處理24小時，及用于qPCR。將數(shù)據(jù)對GAPDH表達 標準化，和通過使用未處理的細胞作為參照測定相對表達。在SSG3細胞中，F(xiàn)ADS2和PPARγ 表達被發(fā)現(xiàn)響應TGFβ1處理而顯著地下調。（c)表達TGFβRIIshRNAl及對照shRNA(Ctr) 的SSG3細胞中的TGFβRII表達顯示敲落效率。（d)。免疫印跡確認用TGFβ15ng/ml刺激 lh的shRNA表達細胞中p_Smad2活性的減小。以下顯示的免疫印跡值，表示用ImageJ，使用 來自各條件的比P_Smad2/Smad2/3定量的相對密度。（e，f)。在轉錄水平的FADS2和PPARγ 減小經(jīng)規(guī)范Smad信號轉導介導。將表達對未處理的對照（Ctr)標準化。在TGFi3RII-缺 陷型SSG3細胞中未檢測到在用TGFβ1處理之后對照SSG3細胞中PPARγ和FADS2基因的 顯著減小。*Ρ_值〈〇· 05, #ρ-值〈0· 001 (配對的2-尾的Student氏t檢驗）。
[0108] 圖5.TGF0信號傳導的抑制誘導原代SSG3細胞中的脂肪生成。（a，b)穩(wěn)定地 表達針于TGFf3RII的shRNA的SSG3細胞由尼羅紅（比例尺，20μπι)和油紅0染色（比 例尺，10μπι)顯示明視場像上脂質滴的蓄積（比例尺，20μπι)。白色箭標顯示相比對照 (Ctr)，shRNA表達細胞中多個脂質滴的存在。24h的TGFi3 1 (5ng/ml)處理在對照細胞中 減小脂質產(chǎn)生的基礎水平，但不影響表達TGFi3RIIshRNA的細胞，主要由油紅0顯示。（c) 顯示相比對照，表達shRNA的SSG3細胞中脂質滴的增加（由白色箭標表示）的電子顯微鏡 檢。比例尺，2μπι。LD，脂質滴。N，核。（d)用尼羅紅標記的表達shRNA的SSG3細胞的流 式細胞術。FL-1測量中性脂質，和SSC反映細胞粒度。已為各條件獲取10, 000個細胞。作 為陽性對照，由0.ImM亞油酸（LA)處理24h的SSG3顯示表示脂質滴的熒光和粒度的增加。 注意相比表達shRNA對照的細胞，表達TGFβRIIshRNA的細胞中熒光增加和粒度增加。與 2種不同的表達TGFi3RIIshRNA的細胞類似，獲得類似結果（見圖10)。
[0109] 圖6.人皮脂細胞分化中TGFi3信號傳導的作用的模型。皮脂腺由在腺外部的增 殖皮脂細胞及分化的皮脂細胞組成，當它們達到了它們的完全成熟階段時在腺的中央填充 脂質。皮脂腺周圍的細胞環(huán)境是多樣的，包括真皮成纖維細胞，脂肪細胞，其可為TGF0配 體的源，以通過降低脂質合成中涉及的基因的表達來維持未分化的狀態(tài)的皮脂細胞。APM: 立毛肌，IRS:內部根鞘，0RS:外部根鞘。
[0110] 圖7.原代人皮脂細胞源于頭皮，乳房，胸及面部組織表達典型皮脂細胞標志物。 (a) 頭皮樣品的蘇木素和伊紅染色。比例尺，50μπι。（b)免疫熒光染色顯示，PPARy(紅 色，在（b'）中由白色箭標顯示）在腺的用α6-整聯(lián)蛋白染色的周邊（綠色，由白色箭 標顯示）及中央，在來自頭皮外植體的人皮脂腺中表達。比例尺，50μπι。放大框住的區(qū)及 顯示于（b'）。（c)Blimpl(紅色，由白色箭標顯示）表達通常見于皮脂腺的分化的細胞及 毛囊的內部根鞘。α6_整聯(lián)蛋白（綠色，由白色箭標顯示）標記腺的基底層。（d)角蛋白 7(紅色，由白色箭標顯示）表達依賴于腺的位置（頭皮，乳房和胸）改變，如由免疫熒光 顯示。（e~g)由2-色免疫印跡，源于頭皮，乳房，胸及面部外植體的皮脂細胞表達皮脂細 胞標志物（Blimpl，c-Myc，Mucl，PPARγ和K7)。SSG4表示源于4歲-頭皮樣品的原代皮脂 細胞。比例尺，5(^111〇3)，5(^111((3和(1)?？s寫 ：56，皮脂腺；冊，毛囊；€[6，€[6-整聯(lián)蛋白； Κ7,角蛋白7。
[0111] 圖8.原代皮脂細胞可體外分化。（a)顯示脂質蓄積的證據(jù)的人頭皮切片（尼羅紅 染色）。比例尺，50μm(b)將源于頭皮外植體的SSG3細胞用0.ImM亞油酸（LA)處理48h， 以分化細胞，及用尼羅紅染色，以檢測脂質。在未處理的及亞油酸-處理的條件，以相同的 曝光時間獲取像。明視場圖像顯示在亞油酸處理之后細胞質脂質滴的蓄積，如由黑色箭標 表示。比例尺，50ym(c)顯示未處理的源于頭皮外植體的皮脂細胞SSG3中的細胞質脂質滴 的電子顯微鏡檢。比例尺，20μπι。放大框住的區(qū)及顯示于（c'）比例尺，500nm。（c"）在 亞油酸處理之后，在SSG3細胞中檢測到增加的高-電子密度脂質滴，及放大于c"'。c"和 c"'的比例尺是2μπι?？s寫：HF，毛囊。SG，皮脂腺。LD，脂質滴。N，核。Mi，線粒體。RER， 粗糙內質網(wǎng)。SER，光滑內質網(wǎng)。
[0112] 圖9.TGF0信號傳導引發(fā)源于乳房和面部的皮脂細胞中脂原性基因的降低的表 達。從源于未處理的或用5ng/ml的TGFi3 1處理24h的乳房和面部的皮脂細胞分離RNA， 及用于實時PCR。實施2次實驗，及全部qPCR反應以一式三份實施。為各細胞群對GAPDH 表達標準化數(shù)據(jù)，和通過使用未處理的細胞作為參考點確定相對表達的變化。（a)FADS2及 (b)PPARy表達被發(fā)現(xiàn)響應TGFi3 1處理而顯著地降低，如顯示于源于頭皮的皮脂細胞（圖 4a~b)，提示TGFβ的抑制性效應不依賴于皮膚組織類型。*p-值〈0. 05 (配對的2-尾的 Student氏t檢驗）。
[0113] 圖10.TGF0信號傳導的抑制誘導原代SSG3細胞中的脂肪生成。（a)相比用shRNA 對照感染的細胞，穩(wěn)定地表達針于TGFf3RII的shRNA(shRNAl)的SSG3細胞顯示明視場像 上脂質滴的蓄積（白色箭標）及由尼羅紅染色（以綠色顯示）。比例尺，20μπι。（b~c)， 相比對照，顯示表達針對TGFi3RII的shRNA(shRNA2)的SSG3細胞中脂質滴的增加（由白 色箭標表示）的電子顯微鏡檢。在表達shRNA的SSG3細胞中檢測指示脂質合成的髓磷脂 圖?？s寫：N，核。LD，脂質滴。b和c的比例尺是2μπι和c'的比例尺是500nm。
[0114] 【實施例3 :化合物的篩選】
[0115] 將原代皮脂細胞用于測試已知為脂肪生成的抑制物或活化物的化合物，及鑒定測 試抑制或活化脂肪生成，或變化或改變脂肪生成的抑制物或活化物的效應的化合物。
[0116] 已知的脂肪生成的抑制物或活化物：
[0117] 雄激素：皮脂產(chǎn)生在雄激素控制下，及毛囊皮脂腺單元異常應答雄激素呈現(xiàn)與痤 瘡的發(fā)病機制相關
[0118] 5α-還原酶抑制物（用于處理雄激素性脫發(fā)）：減少脂肪生成
[0119] 5a-DHT(二-氫睪酮）（雄激素體內刺激皮脂腺的活性）：增加增殖，增加脂肪生 成。
[0120] DHEA(5-脫氫表雄酮）（其為腎上腺的主要分泌留體產(chǎn)物，作用于雄激素受體，對 皮脂腺活性的雄激素性影響）：增加脂肪生成
[0121] 乙酸環(huán)丙孕酮（抗-雄激素）：降低脂肪生成
[0122] 雌激素：雌二醇：降低脂肪生成
[0123] 腎上腺皮質激素：地塞米松：降低脂肪生成
[0124] 類視黃醇：異維甲酸（13-順式視黃酸）：對皮脂細胞的抗-增殖效應，細胞周期停 滯，凋亡效應
[0125] PPAR激動劑：羅格列酮：降低脂肪生成
[0126]
[0127] 可測試TGFβ1配體（10ng/ml)，及應模擬使用針對TGFβRII的shRNA的結果，在 TGF0抑制之后脂質產(chǎn)生增加。
[0128] 材料和方法：對原代SSG3細胞進行實驗，其在實施例1和2中描述。經(jīng)及不經(jīng)用 亞油酸0.ImM誘導48h，對原代SSG3細胞進行實驗，如在實施例2中描述。待在2種處理時 間，24hrs和48hrs亞油酸后處理之后測試3種不同濃度的各活性化合物。當添加活性化合 物時停止亞油酸處理。
[0129] 處理后，由2種方法檢定脂質產(chǎn)生的效應。在第1方法中，待提取mRNA及待實施 實時PCR，以分析在SSG3中顯示在48h的亞油酸處理之后增加的FADS2和PPARy的表達。 在第2方法中，皮脂細胞待用尼羅紅染色。變化待通過使用FACS分析定量。對應熒光待以 2種不同波長（564nm和604nm)測量，其會允許中性脂質蓄積（代表性的皮脂脂質）和極性 脂質（代表性的磷脂）存在的定量。定量在具有用于激發(fā)其的黃-綠激光的機器中由使用 默認濾光器的熒光活化的細胞分選（FACS)來進行。
[0130] 作為對照，SSG3待用TGFβ1處理24h，及應檢測尼羅紅表達的減小。實驗會以一 式三份進行，以獲得顯著數(shù)據(jù)。
[0131] 通過使用配對的2-尾的Student氏t檢驗實施2組（未處理的及處理的）之間 的比較。P值〈0.05會被認為是顯著的。
[0132] 本公開的例示實施方式包括：
[0133] 實施方式1.培養(yǎng)原代皮脂細胞的方法，其包括在適合于培養(yǎng)皮脂細胞的細胞培 養(yǎng)基中培養(yǎng)玻璃片之間所夾的皮脂腺經(jīng)對于在所述皮脂腺上形成皮脂細胞足夠的時間長 度。
[0134] 實施方式2.實施方式1的方法，其中所述玻璃片經(jīng)細胞外基質蛋白包被。
[0135] 實施方式3.實施方式1或2的方法，其中所述細胞外基質蛋白是纖連蛋白。
[0136] 實施方式4.實施方式1~3之任一項的方法，其中所述皮脂腺來自人小兒供體。
[0137] 實施方式5.實施方式1~4之任一項的方法，其還包括，在培養(yǎng)皮脂腺之前，獲得 皮膚樣品，及自皮膚樣品移出皮脂腺。
[0138] 實施方式6.實施方式1~5之任一項的方法，其中所述皮膚樣品來自人小兒供 體。
[0139] 實施方式7.實施方式1~6之任一項的方法，其中所述細胞培養(yǎng)基包含基礎培養(yǎng) 基，表皮生長因子，霍亂毒素，腺嘌呤，胰島素，氫化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有絲 分裂劑。
[0140] 實施方式8.實施方式1~7之任一項的方法，其還包括自皮脂腺移出皮脂細胞， 及在適合于培養(yǎng)皮脂細胞的培養(yǎng)基中，在經(jīng)細胞外基質蛋白包被的玻璃上培養(yǎng)皮脂細胞。
[0141] 實施方式9.實施方式1~8之任一項的方法，其中所述培養(yǎng)基包含基礎培養(yǎng)基， 表皮生長因子，霍亂毒素，腺嘌呤，胰島素，氫化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有絲分 裂劑。
[0142] 實施方式10.實施方式1~9之任一項的方法，其中所述細胞外基質蛋白是纖連 蛋白。
[0143] 實施方式11.培養(yǎng)原代皮脂細胞的方法，其包括在包含基礎培養(yǎng)基，表皮生長因 子，霍亂毒素，腺嘌呤，胰島素，氫化可的松，胚胎牛血清，及抗生素/抗有絲分裂劑的培養(yǎng) 基中，在纖連蛋白包被的玻璃上培養(yǎng)原代皮脂細胞。
[0144] 實施方式12.實施方式11的方法，其中所述原代皮脂細胞源于人小兒供體。
[0145] 實施方式13.分離的培養(yǎng)的皮脂細胞群，其由權利要求1~13之任一項的方法獲 得。
[0146]實施方式14.鑒定調控脂肪生成的化合物的方法，其包括：(a)將測試化合物添加 到實施方式13的培養(yǎng)的皮脂細胞群，及（b)測量測試化合物對皮脂細胞中脂質產(chǎn)生的效 應。
[0147] 實施方式15.實施方式14的方法，其中在添加測試化合物之前，將培養(yǎng)的皮脂細 胞群的部分用亞油酸誘導。