催化多酚糖基化的酶的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】催化多酚糖基化的酶
[0001] 本發(fā)明涉及催化多酚，特別是黃酮類(lèi)化合物、苯甲酸衍生物、芪類(lèi)化合物、查爾酮 類(lèi)化合物、色酮類(lèi)化合物和香豆素衍生物糖基化的酶。
[0002] 多酚是通過(guò)莽草酸和苯丙烷途徑生物合成的植物次生代謝產(chǎn)物。它們是在它們的 環(huán)系統(tǒng)具有羥基的芳族化合物或其衍生物。黃酮類(lèi)化合物和苯甲酸衍生物是多酚的例子。 經(jīng)由環(huán)系統(tǒng)中的羥基的二次修飾，形成這些化合物的多種天然衍生物。糖修飾在自然界中 經(jīng)常發(fā)生，因?yàn)樗鼈儗?duì)化合物的溶解度和功能可能有顯著影響。多酚化合物是水果和蔬菜 形式的我們?nèi)粘I(yíng)養(yǎng)中的一部分，并且已知對(duì)人類(lèi)健康具有積極的影響。除了抗氧化和自 由基清除功能外，它們能夠發(fā)揮例如抗過(guò)敏、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛以及甚至 癌保護(hù)（21)作用。由于這些廣泛影響，在化妝品工業(yè)、制藥工業(yè)和營(yíng)養(yǎng)制品工業(yè)中對(duì)多酚 類(lèi)物質(zhì)如具體的黃酮類(lèi)化合物的需求日益增長(zhǎng)（22-24)。滿足這一需求的主要問(wèn)題來(lái)自它 們的可利用性有限。例如，黃酮類(lèi)化合物僅僅以低水平在植物中產(chǎn)生。提取與大量溶劑的 使用有關(guān)，且由于它們相當(dāng)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)化學(xué)修飾不容易實(shí)現(xiàn)（25)。
[0003]由于定向化學(xué)修飾大多失敗，多酚如黃酮類(lèi)化合物的區(qū)域?qū)Ｒ恍孕揎椚匀缓芾?難。因此，酶已經(jīng)獲得了關(guān)注，因?yàn)樗鼈兡軌蚪閷?dǎo)多酚的區(qū)域修飾和立體化學(xué)修飾（26)。特 別是，研究集中于特定的糖基化，作為修飾影響多酚例如黃酮類(lèi)化合物的水溶性和生物利 用率（27, 28)。催化反應(yīng)的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶（GT)。通常，GT介導(dǎo)糖殘基從供體底物到受體 分子的轉(zhuǎn)移?；谒鼈兊男蛄邢嗨菩裕珿T目前分類(lèi)為94個(gè)家族（29)。GT家族1(GT1)包括 催化親脂性小分子糖基化的酶（30)。使用核苷酸活化的供體的這些酶（EC 2.4. 1.x)屬于 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT)超家族，并且也被稱為L(zhǎng)eloir酶（31，32)。作用于黃酮類(lèi)化合物的 糖基轉(zhuǎn)移酶也屬于GT1 (33)。GT1的酶具有GT-B折疊結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)出關(guān)于轉(zhuǎn)移的糖部分的鍵 合的反相反應(yīng)機(jī)理（34)。EP 2 128 265 A1描述了真菌來(lái)源即來(lái)自木霉屬（Trichoderma) 的糖基轉(zhuǎn)移酶，用于糖基化黃酮類(lèi)化合物。EP 1 985 704 A1公開(kāi)了也作用于黃酮類(lèi)化合 物的來(lái)自玫瑰植物的糖基轉(zhuǎn)移酶。迄今為止，已經(jīng)鑒定并且詳細(xì)表征了極少數(shù)的原核來(lái)源 的黃酮類(lèi)化合物-作用GT1。目前已知的來(lái)源于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的接受黃酮化合物的UGT 都屬于甘露糖苷（macroside)糖基轉(zhuǎn)移酶（MGT)亞族，且來(lái)源于桿菌（Bacilli)和鏈霉菌 (Str印tomycetes) (35-37;另見(jiàn) EP 1 867 729 A1 和 TO 2009/015268 A1)。此外，來(lái)源于 革蘭氏陰性黃單胞菌（Xanthomonas campestris)的單個(gè)黃酮類(lèi)化合物作用UGT是已知的 (38) 〇
[0004] 因此，仍需要用于修飾如黃酮類(lèi)化合物、色酮類(lèi)化合物等多酚的方法。因此，本發(fā) 明的一個(gè)目的是提供這樣的方法。該目的通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題來(lái)解決。本發(fā)明的有利 實(shí)施方案具體陳述在從屬權(quán)利要求中。
[0005] 在第一方面，本發(fā)明提供了催化多酚，例如酚酸衍生物、查爾酮類(lèi)化合物、色酮類(lèi) 化合物、香豆素衍生物、黃酮類(lèi)化合物和芪類(lèi)化合物糖基化的酶，其中所述酶：
[0006] a)包含SEQ ID NO :7-12的序列之一的氨基酸序列；或
[0007] b)由包含SEQIDN0 :1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸編碼；或
[0008] C)與上述a)或b)限定的酶之一同源；或
[0009] d)由一個(gè)核酸編碼，所述核酸在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于包含SEQ ID NO :1_6的序列 之一的核苷酸序列的序列的核酸雜交。
[0010] 本文所描述的新酶表示為GtfC、MgtB、MgtC、MgtS、MgtT和Mgtw，其屬于GT 1家族 并且對(duì)黃酮類(lèi)化合物和類(lèi)似分子等這樣的多酚具有高度活性。
[0011] 本文中的術(shù)語(yǔ)"包含"涵蓋術(shù)語(yǔ)"具有"，即不被解釋為：除了明確提及的要素外的 其它要素一定存在于實(shí)施方案中。例如，術(shù)語(yǔ)"包含SEQ ID NO :X的氨基酸序列的酶"也涵 蓋具有SEQ ID NO :X的氨基酸序列的酶，在這種語(yǔ)境中，"具有"意指僅由SEQ ID NO :X中 的氨基酸組成。
[0012] 在提及核酸、蛋白或肽時(shí)本文所用的術(shù)語(yǔ)"同源性"是指，一個(gè)核酸與另一核酸在 其核苷酸序列上實(shí)質(zhì)相同或相似，或蛋白或肽與另一種蛋白或肽在其氨基酸序列上實(shí)質(zhì)相 同或相似，但與相比較的核酸或蛋白或肽并不完全相同。兩個(gè)核酸或蛋白或肽之間的同源 性的存在可以通過(guò)以下方式來(lái)確定：比較第一序列中的位置與第二序列中的對(duì)應(yīng)位置，從 而確定在該位置是否存在相同或相似的殘基。當(dāng)存在某一最小百分比的相同或相似的核 苷酸或氨基酸時(shí)，兩條比較的序列彼此同源。同一性表示在等同位置比較兩條序列時(shí)，存在 相同的核苷酸或氨基酸。任選地，可能有必要考慮序列空位以便產(chǎn)生可能的最佳比對(duì)。相 似的氨基酸是具有相同或同等化學(xué)和/或物理性質(zhì)的非相同氨基酸。用具有相同或同等 化學(xué)和/或物理性質(zhì)的另一氨基酸替換氨基酸被稱為"保守取代"。氨基酸的物理化學(xué)性 質(zhì)的實(shí)例是疏水性或電荷。就核酸而言，當(dāng)編碼序列中密碼子內(nèi)的一個(gè)核苷酸被替換為另 一核苷酸時(shí)，其稱為相似核苷酸或保守取代，新密碼子例如由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，仍然編 碼相同或相似的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉哪些核苷酸或氨基酸取代是保守取代。為 了確定兩個(gè)核酸之間的相似性或同一性程度，優(yōu)選采用最小長(zhǎng)度為60個(gè)核苷酸或堿基對(duì)， 優(yōu)選最小長(zhǎng)度為 70、80、90、100、110、120、140、160、180、200、250、300、350 或 400 個(gè)核苷酸 或堿基對(duì)，或各自核苷酸序列中至少25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 2%或99. 5%的核苷酸的長(zhǎng)度。對(duì)于蛋白 /肽，優(yōu)選采用最小長(zhǎng)度為20,優(yōu)選的最小長(zhǎng)度為25、30、35、40、45、50、60、80或100,更優(yōu) 選的最小長(zhǎng)度為120、140、160、180或200個(gè)氨基酸，或最小長(zhǎng)度為比較的各個(gè)氨基酸序列 的 25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 2%或99. 5%的氨基酸。特別優(yōu)選各個(gè)蛋白或核酸的全長(zhǎng)用于比較。兩條序 列的相似性或同一性程度可以例如通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序BLAST(19)使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定，參 見(jiàn)例如http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/。同源性的確定依賴于比較的序列的長(zhǎng)度。 對(duì)于本發(fā)明的目的的兩個(gè)核酸，其中較短的核酸包含至少100個(gè)核苷酸，當(dāng)至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、至少99. 2%或99. 5%的核苷酸相同和/或相似（BLAST的"同一性（identities) "或 "相似性（positives)")，優(yōu)選是相同時(shí)，將被認(rèn)為是同源的。在序列長(zhǎng)度為50-99個(gè)核苷酸 的情況下，當(dāng)至少80%、優(yōu)選至少85%、86%、87%、88%、89%或90%的核苷酸相同和/或 相似時(shí)，兩個(gè)核酸被認(rèn)為是同源的。在序列長(zhǎng)度為15-49個(gè)核苷酸的情況下，當(dāng)至少90%、 優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%、99%、99. 2%或99. 5%的核苷酸相同和/或相似時(shí)，兩個(gè) 核酸被認(rèn)為是同源的。在編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸的情況下，如果翻譯的氨基酸序列是同源 的，貝認(rèn)為存在同源性?；诳s寫(xiě)為BLAST的計(jì)算機(jī)程序"Basic Local Alignment Search Tool (基本局部比對(duì)搜索工具）"(19)(例如見(jiàn) http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，使 用 BL0SUM62 取代矩陣（Henikoff, Sand Henikoff, J. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992)，由于考慮了相 似的氨基酸特別是那些不相同的氨基酸，其被指定為"相似（positive) "，即在BL0SUM62取 代矩陣中具有相似性得分（positive score)。對(duì)于本發(fā)明的目的，如果至少55%、優(yōu)選至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 97 %、至少98 %、至少99 %、至少99. 2 %或至少99. 5 %的氨基酸相同或相似，優(yōu)選相同，則 認(rèn)為兩條氨基酸序列之間存在同源性。特別是，兩條序列之間的同源性被假設(shè)為存在的時(shí) 候，當(dāng)使用采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的計(jì)算機(jī)程序BLAST(19);參見(jiàn)例如http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/和BL0SUM62取代矩陣（20)時(shí)，獲得至少55%、優(yōu)選至少60%、至少65%、至 少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少 99%、至少99. 2%或至少99. 5%的同一性或相似性（"相似"），優(yōu)選同一性。本領(lǐng)域技術(shù) 人員使用他的專(zhuān)業(yè)知識(shí)應(yīng)容易地確定哪個(gè)可用的BLAST程序例如eg BLASTp或PLASTn適 合于測(cè)定同源性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉在必要時(shí)他可以使用的評(píng)估同源性的其它程 序。這類(lèi)程序例如可從歐洲生物信息研究所（EMBL)的網(wǎng)站（參見(jiàn)例如http://www.ebi. ac. uk/Tools/similarity. html)上獲得。在本文中使用"X%同源性"或"X%的同源"等這 類(lèi)術(shù)語(yǔ)的情況下，這被解釋為兩個(gè)蛋白或核酸被認(rèn)為是同源的，并具有X%例如80%的序 列相似性或同一性，優(yōu)選同一性。
[0013] 在提到互補(bǔ)核酸的配對(duì)時(shí)，本文使用了術(shù)語(yǔ)"雜交"。雜交和雜交的強(qiáng)度（g卩，核酸 之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度）受到以下因素的影響，如核酸之間的互補(bǔ)程度，涉及的條件的嚴(yán)格性，形 成的雜交體的核酸的Tm( "熔解溫度"），和核酸內(nèi)的G:C比）。
[0014] 術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)格條件下雜交"指的是，在溫度、離子強(qiáng)度以及其它化合物如有機(jī)溶劑 的存在方面的高嚴(yán)格條件，在該條件下進(jìn)行核酸雜交。在"高嚴(yán)格"條件下，僅在具有高頻 互補(bǔ)堿基序列的核酸之間發(fā)生核酸堿基配對(duì)。嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的（例 如參見(jiàn) Green M.R.，Sambrook, J·，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克?。?實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)），Cold Spring Harbor Laboratory Press;第4版，2012)。嚴(yán)格雜交條件的 一個(gè)例子是，當(dāng)使用約500個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的探針時(shí)，在42°C在由5XSSPE(43. 8g/l NaCl， 6. 9g/l NaH2P04H20 和 1. 85g/l EDTA，pH 值用 NaOH 調(diào)節(jié)至 7· 4)、0· 5% SDS、5XDenhardt' s 試劑和100 μ g/ml變性鮭精DNA組成的溶液中雜交，隨后在42°C用含有0. 1XSSPE、1. 0% SDS的溶液洗滌。
[0015] 術(shù)語(yǔ)"糖基化"涉及碳水化合物作為糖基供體被連接至另一個(gè)分子（糖基受體）的 羥基或其它官能團(tuán)的反應(yīng)。
[0016] 術(shù)語(yǔ)"糖基供體"涉及一種碳水化合物，如單糖或低聚糖，其與合適的受體化合物 反應(yīng)以形成新的糖苷鍵。
[0017] 術(shù)語(yǔ)"碳水化合物"包括碳的水合物，即具有化學(xué)計(jì)量公式Cn(H20) n的化合 物。通用術(shù)語(yǔ)包括單糖、低聚糖和多糖，以及通過(guò)還原羰基（糖醇）、通過(guò)一個(gè)或多個(gè) 末端基團(tuán)氧化為羧酸或通過(guò)用氫原子、氨基、硫醇基或類(lèi)似基團(tuán)替代一個(gè)或多個(gè)羥基基 團(tuán)而從單糖衍生的物質(zhì)。它也包括這些化合物的衍生物。參見(jiàn)IUPAC，Compendium of Chemical Terminology (化學(xué)術(shù)語(yǔ)綱要），第 2 版（"Gold Book")，由 A. D. McNaught and A. Wilkinson編譯，Blackwel 1科學(xué)出版社，牛津大學(xué)（1997)，XML的在線修正版本：http: // goldbook. iupac. org(2006_)，由 M. Nic, J. Jirat, B. Kosata 創(chuàng)建；由 A. Jenkins 更新編 譯，ISBN0-9678550-9-8. doi : 10. 1351/goldbook.最后更新：2014-02-24 ;版本：2· 3· 3 ; doi:10.1351/goldbook. C00820。
[0018] 術(shù)語(yǔ)"多酚"涉及次級(jí)植物代謝產(chǎn)物，它們經(jīng)由莽草酸和苯丙烷途徑生物合成的， 且它們是具有一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)羥基直接鍵合到它們的環(huán)系統(tǒng)的芳族化合物或它們的衍 生物。
[0019] 多酚的例子是黃酮類(lèi)化合物、苯甲酸衍生物、芪類(lèi)化合物、查耳酮類(lèi)化合物、色酮 類(lèi)化合物和香豆素衍生物。
[0020] 術(shù)語(yǔ)"黃酮類(lèi)化合物"涉及一組化合物，包括由2-苯基苯并吡喃-4-酮（2-苯 基-1,4-苯并吡喃酮）（例如槲皮素，蘆?。┭苌狞S酮類(lèi)化合物，由3-苯基苯并吡 喃-4-酮（3-苯基-1，4-苯并吡喃酮）衍生的異黃酮類(lèi)化合物，由4-苯基香豆素（4-苯 基-1，2-苯并吡喃酮）衍生的新黃酮類(lèi)化合物。該術(shù)語(yǔ)包括如黃酮類(lèi)化合物（如木犀草 素，芹菜素），黃烷酮類(lèi)化合物（如橙皮素，柚皮素，圣草酚），黃酮醇類(lèi)化合物（如桑色素， 槲皮素，蘆丁，山奈酸，楊梅素，異鼠李素，非瑟酮），黃烷醇類(lèi)化合物（如兒茶素，沒(méi)食子兒 茶素，表兒茶素，表沒(méi)食子兒茶素酸鹽），黃烷酮醇（如黃杉素），查耳酮類(lèi)化合物（查耳酮 衍生物，如異甘草素，根皮素，黃腐酚），異黃酮類(lèi)化合物（如木黃酮，黃豆苷元，甘草西定）， 色酮類(lèi)化合物，即色酮的衍生物（1，4-苯并吡喃酮，苯并吡喃-4-酮），特別是羥基色酮衍生 物（如去甲丁香色原酮），花色素（如矢車(chē)菊，翠雀，二甲花翠素，花葵素，芍藥色素，牽牛花 色素）和橙酮類(lèi)化合物（如金魚(yú)草素），和前述化合物類(lèi)的酰化、糖基化、甲氧基化和磺化 衍生物。另參見(jiàn)IUPAC，Compendium of Chemical Terminology (化學(xué)術(shù)語(yǔ)綱要），第2版 ("Gold Book〃），由 A.D.McNaught and A. Wilkinson編譯，Blackwell 科學(xué)出版社，牛津大學(xué) (1997)，XML 的在線修正版本：http://goldbook. iupac. org(2006_)，由 M. Nic, J. Jirat, B. Kosata 創(chuàng)建；由 A. Jenkins 更新編譯，ISBN 0-9678550-9-8. doi : 10. 1351/goldbook.最后 更新：2014-02-24 ;版本：2. 3. 3 ;doi : 10. 1351/goldbook. R)2424。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"芪類(lèi)"涉及芪的羥基化衍生物，以及它們的衍生物，一個(gè)例子是白藜蘆醇。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"香豆素"涉及香豆素（2H-色烯-2-酮，1-苯并吡喃-2-酮）的衍生物， 特別是羥基化衍生物，例如7-羥基-4-甲基香豆素（4-MU，4-甲基傘形酮）。另參見(jiàn) IUPAC，Compendium of Chemical Terminology (化學(xué)術(shù)語(yǔ)綱要），第 2 版（〃Gold Book")， 由 A. D. McNaught and A. Wilkinson 編譯，Blackwell 科學(xué)出版社，牛津大學(xué)（1997)，XML 的在線修正版本：http://goldbook. iupac. org(2006-)，由 M. Nic, J. Jirat, B. Kosata 創(chuàng)建；由 A. Jenkins 更新編譯，ISBN 0-9678550-9-8. doi : 10. 1351/goldbook.最后更 新：2014-02-24;版本：2. 3. 3 ;doi :10. 1351/goldbook. CO 1369。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"苯甲酸衍生物"涉