用于fret的新化合物及與其相關(guān)的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及用于分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)的化合物及與其相關(guān)的方法、試劑盒和組合物，所述化合物包含基于碳代NADH(carbaNADH)的第一熒光團(tuán)的氧化形式和可在約445至約540nm的波長(zhǎng)激發(fā)且最大發(fā)射大于約560nm的第二焚光團(tuán)?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]許多生物分析方法基于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)的氧化狀態(tài)。NAD具有多個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，其經(jīng)歷了煙酰胺環(huán)內(nèi)的氧化還原反應(yīng)。密切相關(guān)的NADP分子是在腺苷核糖環(huán)的2'位上磷酸化的。[0003]NAD和NADP可通過(guò)正式加入氫負(fù)離子可逆地還原，并且這兩種分子在可逆反應(yīng)中作為輔酶起作用。因此，基于NAD和NADH的酶反應(yīng)適于進(jìn)行熒光分析。[0004]許多氧化還原酶可使用這些輔因子在分子之間轉(zhuǎn)移氫基團(tuán)。因?yàn)檫@些分子的還原形式在其吸收光的能力上不同于它們的氧化形式，所以基于在340nm的光吸收或通過(guò)在445nm光的熒光發(fā)射已經(jīng)定量反應(yīng)。[0005]酶的脫氫酶反應(yīng)可采用如下特性：NAD和NADP的還原形式吸收波長(zhǎng)為340nm的光，而氧化形式則不能。類(lèi)似地，當(dāng)在340nm激發(fā)時(shí)，還原形式能夠在445nm發(fā)射焚光，而氧化形式則不能。這些特性使得定量直接涉及這些輔因子的氧化狀態(tài)變化的反應(yīng)成為可能。例如，當(dāng)在三磷酸腺苷（ATP)存在下，將磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶用于催化由NADH形成NAD時(shí)，三磷酸腺苷的濃度可以熒光強(qiáng)度降低進(jìn)行測(cè)量（美國(guó)專(zhuān)利4,446,231和4,735,897)。[0006]氧化還原酶在血糖水平的定量測(cè)量中也相當(dāng)普及，參見(jiàn)例如EP0293732A2、US2005/0214891A1和US2006/0003397。所有這些公開(kāi)均描述了用于測(cè)量葡萄糖的類(lèi)似的測(cè)試方案，其中使用含有酶-輔酶對(duì)葡萄糖脫氫酶（GlucDH)/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)的試劑系統(tǒng)。GlucDH起作用后，氫負(fù)離子從葡萄糖轉(zhuǎn)移至NAD，從而形成NADH。所得NADH的量與葡萄糖的濃度直接相關(guān)。NADH為強(qiáng)熒光團(tuán)，其濃度可以通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定。樣品中的分析物濃度通常是通過(guò)使測(cè)量的熒光強(qiáng)度與用已知分析物濃度得到的校正曲線相關(guān)聯(lián)來(lái)確定。[0007]顯然，基于酶的測(cè)量系統(tǒng)用于生化分析是臨床相關(guān)分析方法的重要組成部分。這主要是涉及分析物（例如代謝物或底物）的測(cè)量，其直接或間接借助酶進(jìn)行測(cè)定。借助酶-輔酶復(fù)合物將分析物轉(zhuǎn)化并隨后進(jìn)行定量。在該過(guò)程中，待測(cè)定的分析物與合適的酶和輔酶接觸，其中酶通常以催化量使用。輔酶是變化的，例如通過(guò)酶反應(yīng)進(jìn)行氧化或還原。該過(guò)程可例如光度測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)。校正提供測(cè)量值與待測(cè)定的分析物濃度之間的直接關(guān)聯(lián)。[0008]輔酶是與酶共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合且通過(guò)轉(zhuǎn)化分析物而變化的有機(jī)分子。輔酶的突出實(shí)例是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，由此通過(guò)還原分別形成NADH和NADPH。[0009]現(xiàn)有技術(shù)已知的許多基于氧化還原酶的測(cè)量系統(tǒng)具有有限的保質(zhì)期且需要謹(jǐn)慎處理，諸如冷卻或干燥貯存，以達(dá)到足夠的貯存壽命。因此，可發(fā)生不正確、未察覺(jué)的貯存不良引起的結(jié)果。特別是由基本包裝開(kāi)口和長(zhǎng)時(shí)間使用周期引起的干燥劑的耗竭可導(dǎo)致測(cè)量誤差。[0010]上述基于酶的測(cè)量系統(tǒng)的基本組成部分，即酶和輔酶，均可獨(dú)立地有助于這種有限的穩(wěn)定性。例如，已知輔酶諸如NAD和NADP相當(dāng)不穩(wěn)定。[0011]NAD和NADP是文獻(xiàn)中描述的降解途徑的堿不穩(wěn)定性分子（參見(jiàn)例如N.J.OppenheimerinThePyridineNucleotideCoenzymesAcademicPress,NewYork,London1982,J.Everese,B.Anderson,K.Yon,Editors,chapter3,pages56_65)〇ADP-核糖基本上是在通過(guò)裂解核糖和吡啶單元之間的糖基鍵而降解NAD或NADP過(guò)程中形成的。NADH和NADPH的還原形式是酸不穩(wěn)定的；例如差向異構(gòu)化是已知的降解途徑。[0012]NAD/NADP和NADH/NADPH的不穩(wěn)定性是由于核糖和吡啶單元之間的糖基鍵的不穩(wěn)定性。但是，即使在不激烈的條件下諸如在水溶液中，輔酶NAD和NADP可能僅僅由于環(huán)境濕度就已經(jīng)被水解。[0013]碳代NAD類(lèi)似于NAD，其中核糖被碳環(huán)糖單元替代。碳代NAD(或碳-NAD)具有下列結(jié)構(gòu)（I):[00141123456然而，即使當(dāng)使用更穩(wěn)定的輔酶碳代NAD時(shí)，仍有一系列相當(dāng)根本的問(wèn)題與熒光強(qiáng)度的測(cè)量有關(guān)，其包括以下：2基于熒光強(qiáng)度測(cè)量的測(cè)量誤差的一個(gè)重要來(lái)源來(lái)自非特異性光，其到達(dá)來(lái)自環(huán)境的探測(cè)器且可引起非特異性信號(hào)。3所測(cè)量的熒光的強(qiáng)度不僅僅是熒光團(tuán)的量的函數(shù)。相反，它也明顯受其樣品中分子環(huán)境的影響。具體而言，在術(shù)語(yǔ)熒光猝滅下概述的方法導(dǎo)致測(cè)量誤差。4分子的位置和定位可在吸收與發(fā)射之間變化，因?yàn)樵诮y(tǒng)計(jì)學(xué)方法中呈納秒量級(jí)的時(shí)間在分子的激發(fā)和光量子的發(fā)射之間經(jīng)過(guò)。由此導(dǎo)致的干擾影響涉及熒光強(qiáng)度，具體為溫度依賴(lài)性。5熒光一般由紫外線激發(fā)。電子激發(fā)態(tài)的光化學(xué)反應(yīng)可引起熒光團(tuán)的漂白。這是另一個(gè)誤差源。6在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的一個(gè)目的是提出一種方法，其允許具體涉及所述穩(wěn)定性問(wèn)題、測(cè)量誤差和干擾的改進(jìn)的測(cè)量?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0021]本發(fā)明涉及一種化合物，其包含[0022](1)基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)的氧化形式，和[0023](2)可用波長(zhǎng)為445至540nm的光激發(fā)且最大發(fā)射大于560nm的第二焚光團(tuán)，[0024]具體地其中基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)共價(jià)連接。[0025]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于測(cè)定樣品中分析物濃度或量的基于熒光的方法?！揪唧w實(shí)施方式】[0026]本發(fā)明涉及一種化合物，其包含[0027](1)基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)的氧化形式，和[0028](2)可用波長(zhǎng)為445至540nm的光激發(fā)且最大發(fā)射大于560nm的第二焚光團(tuán)，[0029]具體地其中基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)共價(jià)連接。[0030]本發(fā)明化合物具體用于分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)方法，例如，如本說(shuō)明書(shū)中詳述的方法。[0031]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二熒光團(tuán)的最大發(fā)射為560至750nm。[0032]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二熒光團(tuán)可用波長(zhǎng)為445至475nm的光激發(fā)。[0033]基于碳代NADH的第一焚光團(tuán)優(yōu)選可用波長(zhǎng)為300至400nm，優(yōu)選360至380nm，更優(yōu)選365至385nm，最優(yōu)選370至380nm的光激發(fā)。[0034]碳代NADH最大可用波長(zhǎng)為360nm的光激發(fā)。[0035]碳代NADH的最大發(fā)射為465nm。[0036]使用這種用于FRET的化合物克服了基于熒光的方法中NAD衍生的化合物的上述缺陷。如實(shí)施例中所述，化合物N6-[N-(6-"Cy3"氨基己基）氨甲酰基甲基]碳代NADH被證明可用于FRET方法。"Cy3"定義如圖2所示的一類(lèi)化合物并且也被稱(chēng)為2-[3-[1-(己-5-酰基）-1，3-二氫-3,3-二甲基-5-硫代-2H-吲哚-2-亞基]-1-丙烯-1-基]-3,3-二甲基-5-硫代-1-(3-磺基苯基）-3H-吲哚鑰實(shí)體，其中己?；聂驶c氨基己基的氨基連接）。[0037]術(shù)語(yǔ)"基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)"僅用于指基于在400至570nm發(fā)熒光的碳代NAD/碳代NADH氧化還原系統(tǒng)的化合物的還原形式。酶底物通常是呈其氧化形式（碳代NAD)(也稱(chēng)為基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)的氧化形式）的本發(fā)明化合物或熒光輔酶。[0038]本發(fā)明化合物包含碳代NAD部分，并且由此分別包含煙酰胺實(shí)體和腺苷實(shí)體。煙酰胺實(shí)體可被還原成1，4-二氫煙酰胺實(shí)體，其作為熒光團(tuán)起作用。煙酰胺實(shí)體通常是未取代的。腺苷實(shí)體的其余原子可為經(jīng)取代的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這種取代必須與感興趣的酶反應(yīng)相容。這種取代列于Thepyridinenucleotidecoenzymes·NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.91-134中。優(yōu)選的取代基為腺苷酸實(shí)體中2'OH上的磷酸酯基團(tuán)，形成碳代NADP部分。取代基優(yōu)選在腺苷酸核堿基上（Thepyridinenucleotidecoenzymes.NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.103_104tableIItemIIA)。取代的最優(yōu)選位置為腺苷酸核堿基的N6和C8。N6和C8處的合適取代基獨(dú)立地為(^至C12烷基、烯基或炔基(alkinyl)，其任選地被一個(gè)或多個(gè)0、N和/或S原子中斷，并且其中所述(^至C12烷基、烯基或炔基任選地取代有=〇、-OH、-SH、=S或(^至C4烷基，所述烷基任選地被一個(gè)或多個(gè)〇、N或S原子取代或中斷，并且其中N6或C8中的一個(gè)優(yōu)選經(jīng)長(zhǎng)度為25個(gè)原子或更少的連接基分子與第二熒光團(tuán)連接。將基于碳代NAD的部分理解為碳代NAD部分，其如上文所定義任選取代。[0039]碳代NADH的氧化形式，即碳代NAD，具有上述式（I)的結(jié)構(gòu)。[0040]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)的氧化形式為具有式II的基于碳代NADH的第一熒光團(tuán)[0041][0042]其中[0043]Q為冊(cè)況，其中&和R2獨(dú)立地選自H、C連C12烷基、C連C12烯基和C連C12炔基，任選地其中烷基、烯基和炔基的一個(gè)或多個(gè)碳原子用0、N或S代替，和/或[0044]任選地其中所述(^至C12烷基、烯基和炔基取代有=0、-0H、-SH、=S或C1至C4烷基，其中烷基的一個(gè)或多個(gè)碳原子任選地用〇、N或S代替，且[0045]J選自烷基、(^至(：12烯基和(^至(：12炔基，任選地其中烷基、烯基和炔基的一個(gè)或多個(gè)碳原子用〇、N或S代替和/或任選地其中所述(^至C12烷基、烯基和炔基取代有=〇、-OH、-SH、=S或(^至C4烷基，其中烷基的一個(gè)或多個(gè)碳原子任選地用0、N或S代替，具體地其中J和Q中的一個(gè)經(jīng)由長(zhǎng)度為25個(gè)原子或更少的連接基分子與第二熒光團(tuán)連接，且[0046]T為氫原子或磷酸酯基團(tuán)，尤其當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4