肽的 MALD1-T0F 分析
[0038]2.3.1吸取I μ L上述制備好的樣品點(diǎn)靶至不銹鋼靶板，等樣品點(diǎn)干后再在同樣位置上點(diǎn)加I μ L飽和基質(zhì)(洗脫緩沖液+CHCA，濃度為5g/L)，室溫放置干燥。
[0039]2.3.2取I yL校正液于校正點(diǎn)中，同樣加入基質(zhì)后進(jìn)行干燥。
[0040]2.3.3將靶板送入質(zhì)譜儀進(jìn)行打靶并收集質(zhì)譜圖。選定正離子反射模式，激光能量為4200和3000，掃描范圍為m/z 800?5000Da。
[0041]2.4數(shù)據(jù)分析
[0042]MALD1-T0F數(shù)據(jù)采用ConvertPeakList軟件進(jìn)行處理后生成文本文件，再輸入到SpecAlign軟件進(jìn)行處理。利用PAFFT相關(guān)法對(duì)所有質(zhì)譜圖譜峰進(jìn)行比對(duì)；利用總離子量(Total 1n Count，TIC)對(duì)所有質(zhì)譜峰進(jìn)行歸一化整理；利用Cluster 3.0軟件進(jìn)行分層聚簇；利用MarkerView軟件進(jìn)行主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)以及t檢驗(yàn)。不同組別之間的t值及P值利用MarkerView軟件進(jìn)行計(jì)算。尋找不同樣本組的血清、血漿表達(dá)差異多肽。
[0043]2.5多肽鑒定
[0044]經(jīng)過(guò)血清、血漿樣本的PCA分析，選取在不同樣本組中具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的多肽進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)多肽1531.89m/z(結(jié)核特異性檢測(cè)多肽P1，已單獨(dú)提出發(fā)明專利申請(qǐng))在結(jié)核病人血清和血漿樣本中的響應(yīng)值均顯著低于健康對(duì)照，提示該多肽在結(jié)核病人外周血中的含量發(fā)生顯著變化，可能具有判別結(jié)核病人和健康人的價(jià)值。獲得興趣肽后再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析；將二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入B1Tools軟件工具，在MASCOT網(wǎng)站進(jìn)行在線搜庫(kù)，最終鑒定該多肽來(lái)源于凝集素第3亞型。比較三組血清樣本，發(fā)現(xiàn)多肽904.25m/z (結(jié)核特異性檢測(cè)多肽P2)在結(jié)核病人血清中的響應(yīng)值顯著低于疾病和健康對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)附圖1，提示該多肽可能具有判別結(jié)核病人，疾病對(duì)照和健康人的價(jià)值。二級(jí)質(zhì)譜分析最終鑒定該多肽來(lái)源于激肽原I。
[0045]實(shí)施例2:結(jié)核特異性檢測(cè)多肽P2來(lái)源蛋白一一激肽原對(duì)血清標(biāo)本的檢測(cè)
[0046]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0047]1.1血清標(biāo)本:
[0048]18份活動(dòng)性肺結(jié)核患者(痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性)和21份有卡介苗接種史的健康人血清標(biāo)本均為上海市肺科醫(yī)院血清標(biāo)本庫(kù)保存。
[0049]1.2主要試劑:
[0050]人源高分子量激肽原ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。
[0051]1.3相關(guān)試劑的配制:
[0052]見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)
[0053]1.4儀器設(shè)備:
[0054]R0TINA38臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)Jhermo MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)THERMO公司);HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);全自動(dòng)高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；超純水分離系統(tǒng)(英國(guó)USF Elga公司)。
[0055]2.方法及結(jié)果
[0056]2.1標(biāo)準(zhǔn)品配制:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋?xiě)?yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存。取Iml樣品稀釋液加入標(biāo)準(zhǔn)品中振蕩混勻，作為20，000pg/mL貯存標(biāo)準(zhǔn)品。另取8個(gè)離心管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品I 一8的稀釋。稀釋比例按下表中進(jìn)行:
[0057]I, 500pg/mL(l號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)30ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入370ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
[0058]750pg/mL(2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)150ul的I號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
[0059]375pg/mL(3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)150ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
[0060]187.5pg/mL(4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)150ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液[0061 ] 93.75pg/mL(5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)150ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
[0062]46.88pg/mL(6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)150ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
[0063]23.44pg/mL(7號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)150ul的6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
[0064]Opg/mL (空白對(duì)照)直接取稀釋液
[0065]2.2根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。
[0066]每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔均做2復(fù)孔。血清標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
[0067]2.3加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的夾心抗體。蓋上膜板，室溫振蕩溫育I小時(shí)。
[0068]2.4甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
[0069]2.5每孔加入TMB底物10ul，輕輕振蕩混勻，室溫振蕩溫育10分鐘。避免光照。
[0070]2.6取出酶標(biāo)板，迅速加入10ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
[0071 ] 2.7于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值。
[0072]以吸光度OD值為縱坐標(biāo)⑴，相應(yīng)的激肽原標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)⑴，做得相應(yīng)的曲線，樣品的激肽原含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。結(jié)果見(jiàn)附圖2，結(jié)核病人血清中激肽原的含量顯著低于健康人，利用該蛋白可以有效區(qū)分結(jié)核病人和健康對(duì)照，可用于結(jié)核病的血清學(xué)檢測(cè)。
[0073]本發(fā)明的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽，應(yīng)用于結(jié)核病的血清學(xué)檢測(cè)，敏感性高、特異性強(qiáng)；同時(shí)兼顧了血清學(xué)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速，價(jià)格便宜的特點(diǎn)，不需要特殊的大型檢測(cè)設(shè)備，使得基層醫(yī)院也能夠廣泛開(kāi)展高敏感性的結(jié)核病檢測(cè)；同時(shí)，本發(fā)明的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽對(duì)痰涂片陰性的肺結(jié)核，肺外結(jié)核和不易獲得痰標(biāo)本的兒童結(jié)核的診斷均具有重要價(jià)值；另外，本發(fā)明的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽的特異性抗體及其在制備檢核檢測(cè)試劑盒中應(yīng)用對(duì)結(jié)核病檢測(cè)領(lǐng)域同樣意義重大。
[0074]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.結(jié)核特異性檢測(cè)多肽，其特征在于，其多肽序列為SEQID N0.1所示。2.—種檢測(cè)結(jié)核病的試劑盒，其特征在于，將如權(quán)利要求1所述的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽作為檢測(cè)標(biāo)識(shí)物。3.一種如權(quán)利要求1所述的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽的特異性抗體。4.如權(quán)利要求3所述的特異性抗體在制備結(jié)核檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽，其多肽序列為SEQ？ID？NO.1所示，應(yīng)用于結(jié)核病的血清學(xué)檢測(cè)，敏感性高、特異性強(qiáng)；同時(shí)兼顧了血清學(xué)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速，價(jià)格便宜的特點(diǎn)，不需要特殊的大型檢測(cè)設(shè)備，使得基層醫(yī)院也能夠廣泛開(kāi)展高敏感性的結(jié)核病檢測(cè)；同時(shí)，本發(fā)明的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽對(duì)痰涂片陰性的肺結(jié)核，肺外結(jié)核和不易獲得痰標(biāo)本的兒童結(jié)核的診斷均具有重要價(jià)值；另外，本發(fā)明的結(jié)核特異性檢測(cè)多肽的特異性抗體及其在制備結(jié)核檢測(cè)試劑盒中應(yīng)用對(duì)結(jié)核病檢測(cè)領(lǐng)域同樣意義重大。
【IPC分類】G01N33/68, C07K7/06, C07K16/12, G01N33/569
【公開(kāi)號(hào)】CN105254715
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510673889
【發(fā)明人】戈寶學(xué), 楊華, 劉忠華, 鄭瑞娟, 黃曉辰
【申請(qǐng)人】上海市肺科醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日