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      源于緬甸蟒的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制備與應(yīng)用

      文檔序號:9500734閱讀:1001來源:國知局
      源于緬甸蟒的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Pb-CATH4及其基因、制備與應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,設(shè)及一種源于細(xì)甸憐蛇(P^honmolurus bivitta化s)的cathelicidin家族廣譜抗微生物膚Pb-CATH4及其編碼基因,氨基酸序列和 其在化妝品、保健品、食品、飼料等日化添加劑及抗感染醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 化thelicidin是一類由N端信號膚區(qū)域、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域和C端高度特 異的成熟膚區(qū)域構(gòu)成的具有多功能的宿主抗菌膚家族,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是:具有N端信號膚區(qū)域 (30個(gè)殘基左右)、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域巧9-114個(gè)殘基)和C端高度特異的成熟膚 區(qū)域(12-100個(gè)殘基)?;痶helicidin具有廣譜的抗菌活性,能快速、廣譜地殺滅多種病原 微生物,包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、寄生蟲和病毒等,特別是對許多臨床耐藥細(xì) 菌同樣具有作用,運(yùn)引起了人們的注意。除此之外,cathelicidin還具有許多其他生物學(xué) 活性,如對多種免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞)具有趨化作用、誘導(dǎo) 肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋放、調(diào)節(jié)巨隧細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異 細(xì)胞系細(xì)胞調(diào)亡和淋己細(xì)胞活化等。運(yùn)些優(yōu)勢使其在臨床的應(yīng)用有著良好的前景。
      [0003] 近年來由于抗生素的濫用,各種耐藥及超級耐藥菌層出不窮,對臨床的抗感染治 療造成巨大威脅,因此新型抗病原微生物模板的研發(fā)迫在眉睫。Cathelicidins對許多臨床 耐藥細(xì)菌有著很強(qiáng)的殺菌活性,對許多致病菌殺害作用的速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)抗生素的作 用,體外抗微生物測試中,大多數(shù)化thelicidin成熟膚可W在微摩爾和亞微摩爾的濃度下 快速殺死廣泛的微生物。最重要的是由于其特別的殺菌機(jī)制,不會(huì)引起耐藥性。目前發(fā)現(xiàn) 的化thelicidins的殺菌機(jī)制有很多,常見的是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性介導(dǎo)的即通 過靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面,進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜 的孔桐,導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄,從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。此外,抗菌膚還具有其他 的殺菌機(jī)制,如抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制 細(xì)胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。正是由于作用方式的不同,Cathelicidin 介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素,并且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
      [0004] 關(guān)于抗菌膚藥物,目前cathelicidin的研究熱點(diǎn)主要集中在消炎、抗感染和抗真 菌等方面,應(yīng)用方式可W是局部的也可W是系統(tǒng)的,劑型可W是口服也可W外用。尤其由于 陽離子抗菌膚的表達(dá)與皮炎、侵入性燒傷脈血癥、腫瘤病毒引起的肉寶等之間的病理聯(lián)系, 運(yùn)些抗菌膚對運(yùn)些疾病的局部治療有較好的開發(fā)前景。目前有部分抗菌膚藥物已進(jìn)入臨床 試驗(yàn)階段,例如Pexiganan是爪贍抗菌膚Magainin的類似物,目前已作為治療足部感染藥 物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,它也是第一個(gè)進(jìn)行商業(yè)開發(fā)的抗菌膚;Η1Π-11是人乳鐵蛋白前11 個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌膚,通過I/II期臨床試驗(yàn)研究表明Hin-1通過靜脈給藥時(shí)是 安全的、耐受性良好的;來源于豬protegrin的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰瘍,已進(jìn)入 臨床ΙΠ期試驗(yàn)等?;痶helicidin的應(yīng)用不僅限于醫(yī)藥領(lǐng)域,在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和日化用品領(lǐng) 域,cathelicidin也存在巨大的應(yīng)用潛能。
      [0005] 2002年,世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)表公告指出"在牲畜養(yǎng)殖過程中,停止W往慣用的 飼料添加劑抗生素的做法,將在不危害動(dòng)物和農(nóng)民利益的前提下,可減少對人類健康的威 脅??股刈鳛轱暳咸砑觿?yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中,對畜牧業(yè)的發(fā)展起了重要的作用,但是其在 動(dòng)物體內(nèi)和動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留,W及病原菌產(chǎn)生的抗藥性問題,對人類的健康和環(huán)境產(chǎn)生 了負(fù)面的影響。并且完全使我國出口肉類,海產(chǎn)品等受到了限制,從而影響收益。尋找新型、 安全的抗菌劑代替抗生素,已成為當(dāng)前國內(nèi)外飼料學(xué)科的一項(xiàng)重要內(nèi)容??咕w具有廣譜 的抗菌作用,對畜禽具有促生長和治療疾病的功能,是無毒、無害、無殘留的綠色產(chǎn)品,有望 成為抗生素的替代品,在畜牧生產(chǎn)上發(fā)揮重要的作用。目前在畜禽生產(chǎn),水產(chǎn)養(yǎng)殖等均有應(yīng) 有。
      [0006]細(xì)甸憐蛇(P^honmolurusbivittatus),是蛇亞目憐科憐屬印度憐的亞種之一,W體型巨大著稱,平均身長至高可達(dá)7米,體重可達(dá)91公斤,也是世界上最巨型的六種蛇類 之一。細(xì)甸憐屬于東南亞地區(qū)的本±品種,是一種夜行性蛇類,多居于熱帶森林里,在中國 多見于廣東、廣西、福建、云南、海南、貴州等地。目前關(guān)于細(xì)甸憐蛇cathelicidin宿主防御 膚的研究和應(yīng)用還沒有報(bào)道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007] 本發(fā)明提供一種在亞微摩爾劑量下即具有很強(qiáng)的抗微生物活性的來源于細(xì)甸憐 蛇的一種抗微生物膚,Pb-CATH4及其基因、氨基酸序列和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是基于上述 理論研究和現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ),提供一種具有強(qiáng)抗菌活性的細(xì)甸憐蛇抗微生物膚化-CATH4及 其應(yīng)用,著重醫(yī)藥制備,化妝品、保健品、食品和新型飼料添加劑等中的應(yīng)用。
      [000引為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:
      [0009]一種源于細(xì)甸憐的廣譜高效抗微生物膚Pb-CATH4,所述的廣譜抗微生物膚Pb-CATH4是一種直鏈多膚,含有29個(gè)氨基酸殘基,分子量是3492.llDa,理論等電點(diǎn)(pi) 為12. 54,含有9個(gè)堿性氨基酸殘基及17個(gè)疏水性氨基酸殘基。
      [0010] 其序列為:蘇氨酸-精氨酸-絲氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-精氨酸-苯丙 氨酸-異亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-精 氨酸-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨 酸-亮氨酸-鄉(xiāng)氨酸-甘氨酸。
      [0011] 基因測序結(jié)果表明編碼細(xì)甸憐蛇抗菌膚Pb-CATH4前體cathelicidin的基因由 465個(gè)核巧酸組成,自5'端至3'端序列為:
      [0012]
      [0013] 編碼細(xì)甸憐蛇成熟膚化-CATH4的為376位到462位的核巧酸序列,其編碼的氨基 酸序列為:化ri-Arg2-Se;r3-Arg4-T巧 5-Arg6-Arg7-Phe8-Ile9-Arg"-Glyii-Alai2-Gly"-Argi4-P hei5-Alai6-Arg"-ArgiS-Tyri9-Gly2°-Trp2i-Arg22-Ile23-Ala24-Leu25-Gly26_Leu27-Val2S-Gly29。
      [0014] 細(xì)甸憐蛇抗菌膚Pb-CATH4基因的克隆包括:細(xì)甸憐蛇肺總RNA提取,mRNA 純化,mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建,設(shè)計(jì)引物,利用PCR方法篩選細(xì)甸憐蛇抗菌 膚Pb-CATH4 基因。5' 端引物分別為Pl(5'-ATGACGGGTGTTTGGGCACTG-3')和P2 巧 ' -GCTGAAGTTCACCATCAAGGAGAC-3'),PCR另一擴(kuò)增引物為化0NTECH公司Creato/M SMARTTMcDNALibraryConstructionKit中的 3,PCRPrimer引物,其序列為 5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG- 3'。獲得陽性單克隆進(jìn)行基因核巧酸序列測定。
      [001引 Pb-CATH4的化學(xué)制備方法:根據(jù)編碼細(xì)甸憐蛇cathelicidin抗微生物膚基因推 斷的成熟膚化-CATH4氨基酸序列,用自動(dòng)多膚合成儀(433A,AppliedBiosystems)合成其 全序列。通過HPLC反相柱層析脫鹽純化,并確定其純度大于95%。用基質(zhì)輔助激光解析電 離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MLDI-T(F)測定其分子量,等電聚焦電泳測定等電點(diǎn),用自動(dòng)氨基酸測 序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
      [0016] 細(xì)甸憐蛇抗菌膚Pb-CATH4基因可W作為基因工程制備細(xì)甸憐蛇抗菌膚 Pb-CATH4。所述廣譜高效抗微生物膚Pb-CATH4,具有極強(qiáng)的廣譜抗微生物活性,作為制備 抗病原微生物感染藥物或化妝品、保健品、食品、飼料等日化中的添加劑被應(yīng)用。合成的 Pb-CATH4抗菌膚可W溶于滅菌超純水,用于藥理活性檢測。
      [0017] 本發(fā)明基因克隆得到編碼細(xì)甸憐蛇cathelicidin抗微生物膚的基因,通過化學(xué) 合成方法得到成熟膚化-CATH4。該抗微生物膚富含堿性氨基酸,具有很強(qiáng)的抗菌活性,抗菌 實(shí)驗(yàn)顯示其對多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用。另外,其還具有很低細(xì)胞毒性,無溶血 活性,結(jié)構(gòu)簡單,不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu),方便化學(xué)合成及基因工程制備。
      【附圖說明】
      [0018] 附圖是Pb-CATH4對E.coilATCC25922的殺菌動(dòng)力學(xué)圖。
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