一種生物活性多肽yvta及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及蛋白領(lǐng)域，具體設(shè)及一種生物活性多膚YVTA及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于生物活性膚作為促進(jìn)健康的生物活性成分，具有傳遞生理信息，調(diào)節(jié)生理功 能的作用，對(duì)于人體的神經(jīng)、消化、生殖、生長、運(yùn)動(dòng)、代謝、循環(huán)等系統(tǒng)的正常生理活動(dòng)的維 持非常重要。它們不僅具有抗病毒、細(xì)菌、抗高血壓、降膽固醇等作用，而且作為免疫調(diào)節(jié)劑 具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗腫瘤等功能；能夠清除自由基具有延緩衰老的功效，是當(dāng)前國際食品 界最熱口的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。各種活性膚常作為功能食品添加成分用 于食品的實(shí)踐生產(chǎn)，特別是在乳飲料、食品添加劑的應(yīng)用方面已經(jīng)取得良好效果。乳源性生 物活性膚的功能及對(duì)消費(fèi)者的健康的影響正備受重視。
[0003] 近年來，越來越多的科學(xué)研究表明很多來源于生物蛋白的小膚具有多種生物學(xué)活 性，如激素作用、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等。同時(shí)， 研究發(fā)現(xiàn)小膚可W被人體更好地吸收和利用，改變了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)只能被降解成氨基酸才 能被吸收利用的觀點(diǎn)。在眾多生物蛋白中各種牛乳蛋白是非常重要的生物活性多膚來源之 一，它們被乳酸菌分解利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變?yōu)槎嗄w或者游離的 氨基酸，最終被人體消化吸收或通過小腸上皮細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)直接進(jìn)入人體的血液循環(huán)， 發(fā)揮其生物活性作用。
[0004] 因此，運(yùn)些生物活性小膚不僅成為篩選藥物的天然資源寶庫，也是功能性食品工 業(yè)的主要原料成分。目前，生物活性膚的制備及其應(yīng)用開發(fā)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)研究的熱 點(diǎn)。
[0005] 免疫活性膚是繼阿片膚發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生 物活性膚。1981年，化lies等人首次發(fā)現(xiàn)，利用膜蛋白酶水解人乳蛋白，從水解物中 得到一種免疫活性膚段，其氨基酸序列為Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr，該短膚被證明在 體外實(shí)驗(yàn)中能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨隧細(xì)胞對(duì)綿羊血紅細(xì)胞的吞隧作用，靜脈注射，則能 增強(qiáng)小鼠對(duì)肺炎克氏桿感染的抵抗能力。Elitsur等人經(jīng)胃蛋白酶處理酪蛋白得到 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu和Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu，研究證明該兩短膚不僅具 有阿片樣活性，也具有免疫調(diào)節(jié)活性，可增強(qiáng)淋己細(xì)胞增殖，提高自然殺傷細(xì)胞（NK)能力， 促進(jìn)隧中性白細(xì)胞的移動(dòng)。張少輝等人利用瑞±乳桿菌發(fā)酵脫脂乳獲得了生物活性多膚 犯P化及其降解產(chǎn)物犯PV，經(jīng)過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)、體外免疫功能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了多膚犯PV 具有較好的抗氧化生物學(xué)活性和促進(jìn)細(xì)胞免疫的活性，一方面能夠清除機(jī)體內(nèi)的自由基， 減少自由基對(duì)人體的傷害；另一方面，生物活性多膚犯WL和犯PV還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力， 增強(qiáng)淋己細(xì)胞、巨隧細(xì)胞的增殖能力，使巨隧細(xì)胞一氧化氮誘生量增加，并促巨隧細(xì)胞分泌 細(xì)胞因子。
[0006] 盡管牛乳蛋白內(nèi)隱含有許多具有生物活性的膚序列，但運(yùn)些生物活性膚序列只有 通過一定的手段將其釋放出來才能發(fā)揮作用。獲取乳蛋白源活性膚的主要手段有兩種：發(fā) 酵，利用微生物（乳酸菌）發(fā)酵乳源蛋白獲??；酶解，包括來自動(dòng)物的消化道酶和來自植物 和微生物的蛋白酶。
[0007] 研究結(jié)果表明乳源性生物活性膚作為一類小分子物質(zhì)，W其分子量低、活性強(qiáng)、用 量少的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已越來越多的引起人們的重視。所W它們不僅僅作為功能性食品原料用 于各種功能性食品的制造，而且作為免疫調(diào)節(jié)劑具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗腫瘤等功能；能夠清 除自由基具有延緩衰老的功效。此外，多數(shù)乳源性生物活性膚能夠抵抗胃腸道的消化，在小 腸內(nèi)W完整的形式被機(jī)體吸收，而不必被分解成單個(gè)氨基酸，具有易消化吸收，食用安全性 極高。因此乳源性生物活性膚的能夠提高機(jī)體抵御外界不良因素的刺激、降低機(jī)體發(fā)病率 等功能特性備受重視，有望成為具有清除自由基、減少患癌幾率和延緩衰老的非藥物性物 質(zhì)原料，在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景，今后必將成為國際食品界和 生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界的最熱口的研究課題，為提高人類健康水平、不得病或者說少得病、延緩衰 老、延長壽命發(fā)揮重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種分離的生物活性多膚YVTA及其制備與應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的生物活性多膚YVTA，其包括
[0011] (a)由Tyr-Val-T虹-Ala(SEQIDNO:1)所示的氨基酸組成的多膚；
[0012] 化）或在SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸且具有同等活性的由（a)衍生的多膚。
[0013] 較優(yōu)的，所述生物活性多膚的來源為乳源性。
[0014] 本發(fā)明的生物活性多膚YVTA為乳源性，具體來源于乳鐵蛋白，并且為乳鐵蛋白(SEQIDNO:2)第665~668位的氨基酸殘基。
[001引所述乳鐵蛋白的氨基酸序列為既有技術(shù)，序列如SEQIDNO:2所示：

[0017] 較優(yōu)的，所述生物活性多膚YVTA具有體外抗氧化活性和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能。
[0018] 本發(fā)明的生物活性多膚YVTA可W通過基因工程的方法和化學(xué)方法人工合成，也 可W從乳制品中通過分離純化、酶降解的方法獲得。
[0019] 本發(fā)明還公開了編碼前述生物活性多膚YVTA的核巧酸片段。
[0020] 乳鐵蛋白的氨基酸序列W及核巧酸序列為既有技術(shù)，編碼乳鐵蛋白（SEQID NO:2)第665~668位的氨基酸殘基的核巧酸片段能編碼成熟的生物活性多膚YVTA。
[0021] 本發(fā)明第二方面，提供了前述生物活性多膚的制備方法，包括如下步驟：
[002引1)發(fā)酵：將瑞±乳桿菌添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞±乳桿菌發(fā)酵乳； [002引。破壁：對(duì)發(fā)酵乳離屯、后得到的菌體進(jìn)行超聲，破碎菌壁使胞內(nèi)膚游離，獲得菌 膚混合液；
[0024] 3)多膚的粗提：對(duì)步驟2)中的菌膚混合液的進(jìn)行低溫離屯、分離，取上清液；
[00幼 4)多膚的純化：
[0026] a.對(duì)步驟3)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液；
[0027] b.固相萃取柱分離：收集的濾液采用WatersS巧-pakC18固相萃取柱萃取，收集 生物活性多膚混合物；
[0028] 5)多膚的消化及穩(wěn)定性：采用兩步酶解法酶解步驟4)的生物活性多膚混合物，獲 得被消化后的生物活性多膚混合物；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采 用的酶為膜酶。
[0029] 本發(fā)明所述脫脂乳為經(jīng)過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于0. 1%。
[0030] 較優(yōu)的，步驟1)中，瑞：t乳桿菌為瑞：t乳桿菌（Xactobacillus helveticus,CICC6024)〇
[0031] 較優(yōu)的，步驟1)中，所述厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵溫度36~38°C，發(fā)酵培養(yǎng)6~ 她；更優(yōu)選發(fā)酵溫度37 °C，發(fā)酵培養(yǎng)化。
[0032] 較優(yōu)的，步驟2)所述離屯、的條件為：20°C，4000~5000;rpm，離屯、15min.。
[003引較優(yōu)的，步驟。所述破壁的條件為：菌體濃度0. 0238g/ml，破碎功率300W，破碎總 時(shí)間26min(超聲3s,間隔5s)。
[0034] 較優(yōu)的，步驟3)中，所述低溫離屯、的條件為：4°C，8000~10000巧m，離屯、15~ 30min〇
[0035] 較優(yōu)的，步驟4)a中，所述超濾處理所采用的是截留分子量分別為3kDa的超濾管。
[0036] 更優(yōu)的，步驟4)a中，所述超濾處理過程中，轉(zhuǎn)速為4800r/min，時(shí)間為30min，離屯、 溫度為4°C。
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