一種活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取純化藻藍(lán)蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種生化分離純化技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種藻藍(lán)蛋白的分離純化方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)藻是一類微小的原核生物，伴隨著富營養(yǎng)化會大量生長形成水華，危害水體水 質(zhì)。其中在夏天由水溫升高形成的水華主要為銅綠微囊藻。目前有關(guān)水華藍(lán)藻的資源化利 用主要集中在兩方面：堆肥處理和藍(lán)藻中有效物質(zhì)提取。
[0003] 藻藍(lán)蛋白是一種普遍存在于藍(lán)藻細(xì)胞中的捕光色素蛋白，其基本組成單位是α 亞基和β亞基，亞基分子量在17KDa和22KDa之間。藻藍(lán)蛋白的純度越高，售價越高，根據(jù) 其純度的不同可分為：食品級> 0. 7,藥品級> 3. 0和試劑級> 4. 0。藻藍(lán)蛋白具有抗氧化 性、抗癌性、免疫巧光性等功效，被廣泛用作天然色素（食品、化妝品、染料等）、醫(yī)藥保健品 和分子生物學(xué)研究中的巧光試劑。水華藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的含量達(dá)5%W上，從水華藍(lán)藻中提 取純化較高純度的藻藍(lán)蛋白，即可實現(xiàn)水華藍(lán)藻的無害化，又可實現(xiàn)其資源化。
[0004] 傳統(tǒng)的藻藍(lán)蛋白提純方法包括：透析、雙水相萃取、徑基憐灰石等柱分離和多步鹽 析。透析法周期較長，提純效果有限；雙水相萃取法純化效果有限，且藻藍(lán)蛋白易與PEG結(jié) 合；徑基憐灰石等柱分離純化效果明顯，但操作成本高昂，藻藍(lán)蛋白回收率低；多步鹽析法 應(yīng)用廣泛，純化效果較好，但操作繁瑣，周期較長。 陽0化]針對運一現(xiàn)狀，本發(fā)明吸取鹽析法的優(yōu)點，采用活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取純 化藻藍(lán)蛋白，原理是活性炭的孔隙結(jié)構(gòu)能夠吸附色、嗅、味和有機物，可W有效去除藻液中 的藻毒素、葉綠素、嗅味物質(zhì)和有機物，使藻藍(lán)蛋白純度得到較大的提升，條件溫和、易于放 大；而鹽析法使用中性鹽來中和溶液中蛋白質(zhì)的電性，并與水結(jié)合破壞蛋白質(zhì)表面的水化 膜，使蛋白質(zhì)相互結(jié)合形成沉淀析出，應(yīng)用成熟、材料廣泛。相比較傳統(tǒng)的提純方法，采用活 性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取純化藻藍(lán)蛋白操作簡單、周期短、成本低、制備量較大、蛋白質(zhì) 回收率高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽 析法提取純化藻藍(lán)蛋白的方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中藻藍(lán)蛋白提純效果低、操作繁瑣，周期 較長等問題。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取 純化藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下步驟:A.將藍(lán)藻進(jìn)行破壁W產(chǎn)生藻液化將所述藻液進(jìn)行 固液分離，然后將所得液體進(jìn)行離屯、，之后取上清液，W獲得藻藍(lán)蛋白粗提液；C.向上述藻 藍(lán)蛋白粗提液中加入適量活性炭，攬拌并靜置后離屯、，再次獲得上清液；D.向步驟C中獲得 的上清液中加入硫酸錠，攬拌并靜置后離屯、，第Ξ次獲得上清液化向步驟D中獲得的上清 液中追加適量硫酸錠，攬拌并靜置后離屯、，獲得沉淀，將沉淀用憐酸緩沖液溶解，獲得藻藍(lán) 蛋白溶液。
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟A是將-10°c條件下冷凍保存的新鮮藍(lán)藻在25~35°C下融化， 然后再放入-10°c條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，可W實現(xiàn)藍(lán)藻細(xì)胞的破壁。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟B是將藍(lán)藻破壁后的溶液用多層紗布粗過濾，去除藻渣。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟C中所用活性炭為粉末狀活性炭；活性炭粉末添加的質(zhì)量濃度 范圍為100~200g/L，靜置時間為5~20min。
[0011] 優(yōu)選地，所述活性炭粉末顆粒目數(shù)> 200目。
[0012] 優(yōu)選地，所述活性炭粉末為煤質(zhì)活性炭粉末。 陽01引優(yōu)選地，所述步驟D中硫酸錠添加量為0. 8~1. 2mol/L。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟E中追加硫酸錠使其物質(zhì)的量濃度達(dá)到1. 8~2. 2mol/L
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟E中溶解用的憐酸緩沖液的濃度為0. 0025mol/L。
[0016]優(yōu)選地，離屯、溫度均為4°C，離屯、速度均為8000轉(zhuǎn)/分。
[0017] 上述步驟制備的（Aew/AzJ> 3.0,滿足藥品級藻藍(lán)蛋白純度的要求。
[0018] 如上所述，本發(fā)明的一種活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取純化藻藍(lán)蛋白的方法，具 有W下有益效果：本發(fā)明提供的藻藍(lán)蛋白制備方法具有操作簡單、成本低廉、蛋白質(zhì)回收率 高、適合工業(yè)化生產(chǎn)等特點。本方法的藻藍(lán)蛋白回收率>30%，藻藍(lán)蛋白的純度（Aew/AzJ > 3. 0。王巍杰在其《鹽析法分離藻藍(lán)蛋白的研究》（食品科技2010年第35卷第5期第 238-241頁）一文中提出，將螺旋藻經(jīng)過六步鹽析操作后，藻藍(lán)蛋白純度可達(dá)3. 61，回收率 為47. 13%。螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的含量高達(dá)10%~20%，本發(fā)明W藻藍(lán)蛋白含量5%的藍(lán) 藻為原料制備藥品級藻藍(lán)蛋白，與傳統(tǒng)多步鹽析法相比，在達(dá)到藥品級純度> 3.0的要求、 并兼顧蛋白質(zhì)回收率的前提下，省去了近Ξ分之一的操作步驟，節(jié)省了時間，減少了試劑用 量，節(jié)約了成本，提高了藻藍(lán)蛋白提純的效率，并可W放大。因此，本發(fā)明提供的藥品級藻藍(lán) 蛋白提取純化方法為實現(xiàn)水華藍(lán)藻的資源化、推動藻藍(lán)蛋白的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示為本發(fā)明的活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取純化藻藍(lán)蛋白的流程圖。
【具體實施方式】
[0020] W下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所掲露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可W通過另外不同的具體實 施方式加W實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可W基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。需說明的是，在不沖突的情況下，W下實施例及實施 例中的特征可W相互組合。
[0021] 需要說明的是，W下實施例中所提供的圖示僅W示意方式說明本發(fā)明的基本構(gòu) 想，遂圖式中僅顯示與本發(fā)明中有關(guān)的組件而非按照實際實施時的組件數(shù)目、形狀及尺寸 繪制，其實際實施時各組件的型態(tài)、數(shù)量及比例可為一種隨意的改變，且其組件布局型態(tài)也 可能更為復(fù)雜。
[0022] 本發(fā)明提供的活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取純化藻藍(lán)蛋白，其原理是：活性炭的 孔隙結(jié)構(gòu)能夠吸附色、嗅、味和有機物，將其加入藻藍(lán)蛋白粗提液中，可W優(yōu)先吸附分子量 500~3000的有機物，如藻毒素、葉綠素、嗅味物質(zhì)和其他小分子量雜質(zhì)，使得溶液中雜質(zhì) 的減少量遠(yuǎn)大于藻藍(lán)蛋白的損失量，從而使藻藍(lán)蛋白的純度得W較大幅度提升；硫酸錠鹽 析具有初步純化和濃縮雙重效果，硫酸錠可結(jié)合蛋白質(zhì)溶液中的相反電荷粒子，中和蛋白 質(zhì)的電性，同時硫酸錠還會與水結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面水化膜的破壞，使蛋白質(zhì)相互結(jié) 合聚集形成沉淀析出，通常用低濃度的硫酸錠去除雜蛋白等雜質(zhì)，再用高濃度硫酸錠溶液 沉淀藻藍(lán)蛋白。
[0023] 請參閱圖1，本發(fā)明提供一種活性炭預(yù)處理聯(lián)合鹽析法提取純化藻藍(lán)蛋白的方法， 包括W下步驟：
[0024] A.取-10°C條件下冷凍保存的新鮮藍(lán)藻1L(含水率96. 2%)在25~35°C條件下 解凍，然后再放入-10°C條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，可實現(xiàn)藍(lán)藻細(xì)胞的破壁，使藻藍(lán) 蛋白從細(xì)胞內(nèi)流出。
[00巧]B.將破壁后的新鮮藍(lán)藻漿液用多層紗布粗過濾，去除藻渣；然后在4°C下進(jìn)行 8000轉(zhuǎn)/min的高速離屯、，離屯、時間30min，棄去渣淳，取上清液，W獲得藻藍(lán)蛋白粗提液。 [00%]C.取40ml藻藍(lán)蛋白粗提液，向其中加入活性炭粉末（活性炭粉末顆粒目數(shù)> 200 目，優(yōu)選為煤質(zhì)活性炭粉末），使其質(zhì)量濃度為100~200g/l，充分?jǐn)埌韬箪o置5~20min; 然后在4°C下進(jìn)行8000轉(zhuǎn)/min的高速離屯、，離屯、時間20min，棄去渣淳，再次獲得上清液。
[0027]化向步驟C中離屯、后獲得的上清液中加入硫酸錠充分?jǐn)埌枞芙猓谷芤褐辛蛩徨V 的物質(zhì)的量濃度達(dá)到0. 8~1. 2mol/L;隨后在4°C下進(jìn)行8000轉(zhuǎn)/min的高速離屯、，離屯、時 間20min，棄去渣淳，第Ξ次獲得上清液。
[002引E.向步驟D獲得的上清液中加入硫酸錠充分?jǐn)埌枞芙?，使溶液中硫酸錠的物質(zhì)的 量濃度達(dá)到1. 8~2. 2mol/L;隨后在4°C下進(jìn)行8000轉(zhuǎn)/min的高速離屯、，離屯、時間20min， 獲得沉淀；將離屯、后獲得的沉淀用0. 0025mol/L憐酸緩沖液溶解，獲得藥品級藻藍(lán)蛋白溶 液。
[0029] W下提供四個實施例，各實施例步驟C的參數(shù)列于表1，步驟D的參數(shù)列于表2,步 驟E的參數(shù)列于表3。藻藍(lán)蛋白的吸光度用紫外-可見分光光度儀檢測，藻藍(lán)蛋白純度計算 依據(jù)公式P=Aezo/Azs。，藻藍(lán)蛋白濃度計算依據(jù)公式X= (Ae2(T〇. 7*Ae5〇)/7.38,回收率計算 依據(jù)公式Y(jié)= (CtVt/CeV。）X100%，其中：A2w、Ae2e、Aeg。分別為波長280、620、650nm處的吸光 度；Ct為樣品溶液中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度；C。為粗提液中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度；Vt為樣品溶 液的體積；V。為粗提液的體積。 I；0030] 實施例一；
[0031] A.取-10°C條件下冷凍保存的新鮮藍(lán)藻1L(含水率96. 2%)在25~35°C條件下 解凍，然后再放入-10°C條件下冷凍，重復(fù)此步驟至少2次，可實現(xiàn)藍(lán)藻細(xì)胞的破壁，使藻藍(lán) 蛋白從細(xì)胞內(nèi)流出。
[0032] B.將破壁后的新鮮藍(lán)藻漿液用多層紗布粗過濾，去除藻渣；然后在4°C下進(jìn)行 8000轉(zhuǎn)/min的高速離屯、，離屯、時間30min，棄去渣淳，取上清液，W獲得藻藍(lán)蛋白粗提液。
[0033]C.取40ml藻藍(lán)蛋白粗提液，向其中加入活性炭粉末（活性炭粉末顆粒目數(shù)>200 目，優(yōu)選為煤質(zhì)活性炭粉末），使其質(zhì)量濃度為lOOgA，充分?jǐn)埌韬箪o置lOmin;然后在4°C 下進(jìn)行8000轉(zhuǎn)/min的高速離屯、，離屯、時間20min，棄去渣淳，再次獲得上清液。
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