一種提高荔枝焦核率的菌液和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種提高慕枝焦核率的菌液和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 慕枝是我果南方的特色水果，種子大小是影響慕枝果實品質(zhì)的重要性狀之一，焦 核慕枝可食率高，口感也較好。焦核率是評估慕枝品質(zhì)的一個非常重要的指標(biāo)。目前栽培 的優(yōu)質(zhì)慕枝品種如廣東的懦米機(jī)、桂味；福建的蘭竹、綠荷包，廣西的靈山香慕等，均W焦核 為特征。
[0003] 大核慕枝品種市場售價低，部分?jǐn)∮贩N如桂味，因焦核率不同價格也有較大差 異，種子大小直接影響慕枝的價格和慕農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益。有研究發(fā)現(xiàn)使用青鮮素可有效提高 慕枝的焦核率，然而，青鮮素處理常導(dǎo)致嚴(yán)重的幼果脫落或成熟果實偏小，不具商品價值等 不良影響，無法在生產(chǎn)上使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提高一種提高慕枝 焦核率的菌液和方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案予W實現(xiàn)的：
[0006] 一種提高慕枝焦核率的菌液，所述菌液為含有沉默表達(dá)載體的LcCWAIs基因片段 轉(zhuǎn)化獲得的農(nóng)桿菌工程菌。
[0007] 本發(fā)明通過病毒介導(dǎo)的基因沉默表達(dá)技術(shù)，將LcCWAIs基因片段和病毒載體結(jié)合 令LcCWAIs基因沉默表達(dá)，最終可獲得使慕枝種胚敗育的效果，因此，構(gòu)建LcCWAIs基因的 沉默表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，即可獲得一種提高慕枝焦核率的菌液。
[000引優(yōu)選地，所述LcCWAIs基因片段的序列如SEQIDNO:1所示。
[0009] 優(yōu)選地，所述沉默表達(dá)載體為pTRVl和PTRV2。
[0010] 本發(fā)明還提供一種提高慕枝焦核率的方法，是利用上述菌液浸染慕枝植株。
[0011] 優(yōu)選地，所述慕枝植株為盛花期的植株或花后3周前結(jié)有幼果的植株。
[001引優(yōu)選地，所述菌液的ODe。。為0. 5~1. 5。
[0013] 優(yōu)選地，所述浸染的方式為噴灑、浸沒、注射。
[0014] 另外，申請人通過研究發(fā)現(xiàn)，對于不同的慕枝品種，所述浸染液的浸染方式有所不 同，例如，可W在慕枝盛花期浸染花穗，也可W在慕枝盛花期對花穗進(jìn)行噴灑，也可W在慕 枝盛花后3周前通過注射的方式將浸染液注射入果柄或種柄。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0016] 本發(fā)明提供了一種提高慕枝焦核率的菌液，所述菌液為含有沉默表達(dá)載體的 LcCWAIs基因片段轉(zhuǎn)化獲得的農(nóng)桿菌工程菌；利用所述菌液浸染慕枝植株，有效抑制了大 核慕枝品種種子的發(fā)育，提高了大核慕枝的焦核率，該方法簡單，成本低，經(jīng)實驗驗證對果 核的調(diào)控有著較成功的效果，并且沉默效果僅維持半個月，僅在種子發(fā)育期起作用，過后自 動失效，不會有殘留，不會對后期的果實生長產(chǎn)生影響，在生產(chǎn)上有著廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017]圖1為部分慕枝組織RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道1~4為慕枝葉片 樣品，泳道5~8為慕枝種皮樣品，泳道9~12為慕枝種柄樣品，泳道13~14為慕枝花的 樣品，泳道15~16為慕枝種仁樣品。
[0018] 圖2慕枝和其他植株種類CWAI基因進(jìn)化樹分析。
[001引 圖3為TRV1 (a)和TRV2化）結(jié)構(gòu)示意圖，其中，RdRP為RNA依賴的RNA聚合酶；1服 為富含半脫氨酸的16kDa蛋白；Mp為運(yùn)動蛋白；Cp為衣殼蛋白；MCS為多克隆位點(diǎn)。
[0020] 圖4為"9911"沉默處理后種子重量分布（A)和種子發(fā)育情況做；其中，圖B中， 第一排是pTRV2-LcCWAI處理；第二排是PTRV2處理。
[0021] 圖5為"硬枝早紅"沉默處理后種子發(fā)育情況（A、B)果重和種子重量分布（0,其 中，圖A和圖B中，第一排是pTRV2-LcCWAI處理；第二排是PTRV2處理。
[0022] 圖6為"馬貴慕"進(jìn)行處理后各處理濃度對種子重量的影響。
[0023]圖7為"馬貴慕"進(jìn)行各梯度濃度處理后種子敗育情況。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[00巧]實施例1酸性轉(zhuǎn)化酶基因篩選和克隆
[0026] -、慕枝樣品RNA的提取W及質(zhì)量檢測
[0027] 采用華越洋超快型RNA提取試劑盒（具體方法參照說明書）對"妃子笑"、"黑葉" 和"懦米機(jī)"慕枝的葉片、花、果皮、果蒂、種皮、種仁等組織的RNA進(jìn)行提取，RNA的濃度用紫 外核酸蛋白檢測儀，取1μ1測定260皿與280皿的比值，若介于1. 80~2.00之間則可W 進(jìn)行下一步實驗。如果RNA濃度較高，可W稀釋一定倍數(shù)后檢測。
[002引瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，可W看出RNA呈現(xiàn)出清晰的28S和18S兩條帶， 并且28S的亮度是18S的兩倍左右，沒有拖尾現(xiàn)象，無DNA污染。表明提取的RNA質(zhì)量比較 高，無明顯降解，滿足后續(xù)實驗的需要。
[0029] 二、細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因的篩選和聚類分析
[0030]根據(jù)慕枝基因組測序結(jié)果，調(diào)出注釋為Cellwallinvertase的相關(guān)基因（一共 14個），經(jīng)NCBI比對（與其他物種中相關(guān)酸性轉(zhuǎn)化酶基因比對）和生物信息學(xué)分析軟件分 析，利用MEGA5進(jìn)行聚類分析后刪除同源性較差的個別成員，用生物信息學(xué)在線分析網(wǎng)站 Smart工具化ttp://sma;rt.embl-heide化erg.de/)刪除掉一些不具備完整功能或者基因 組注釋錯誤的成員，最后篩選出5個結(jié)構(gòu)完整，與細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶的氨基酸保守功能域 一致的基因LcCWAIs(表1，轉(zhuǎn)化酶基因Genbank分類號見表2)，分別為LcCWAIl、LcCWAI2、 LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5,對慕枝和5個其他品種已報道的CWAI、SAI和細(xì)胞質(zhì)中性/堿 性轉(zhuǎn)化酶（NI)基因用MEGA5進(jìn)行聚類分析（圖2)，可W看出基因LcCWAIs大致聚成Ξ類， NI基因聚成一類，液泡酸性轉(zhuǎn)化酶聚成一類，CWAI的5個基因和其他物種已報道的細(xì)胞壁 酸性轉(zhuǎn)化酶基因聚在一起，表明篩選出的基因確實是CWAI基因。慕枝的CWAI又被歸成Ξ 小類。其中LcCWAIl聚成一類，LcCWAI2聚成一類，LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5比較相近聚 成一類。
[0031] 表1慕枝細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因LcCWAIs的基本信息
[0032]
[0033] 表2用于進(jìn)化樹構(gòu)建的轉(zhuǎn)化酶類基因GeneBank分類號[0034]
[0035]
[0036]
[0037] |立、細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因lIcCWAIs
的克隆~' '
[0038] (一）LcCWAIs克隆
[0039] 分別提取"黑葉"、"妃子笑"和"懦米機(jī)"葉片的RNA，WRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，之后利用M-MLVFirstcDNASynthesisKit(invitrogen公司）WcDNA為模板，根據(jù) 慕枝基因組測序結(jié)果中LcCWAIs的全長序列，用PrimerPremier5. 0軟件分別于其起始子 和終止子處設(shè)計引物（引物序列如表3,委托生工生物工程（上海）有限公司合成），擴(kuò)增 目的基因的全長；使用東洋紡生物科技有限公司的KOD-Plus-NeoTaq聚合酶，具體反應(yīng)體 系參照說明書。擴(kuò)增條件為94°C，2min;98°C，10s，55°C(其中LcCWAIl退火溫度為57°C)， 30s，72°C，2min，35個循環(huán)；72°C，10min。反應(yīng)結(jié)束后取2μl跑膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是否正確。
[0040] 表3慕枝LcCWAIs基因的全長擴(kuò)增引物
[0041]
[004引（二）PCR產(chǎn)物加A和目的基因的回收
[0043] 由于K0D為平末端聚合酶，為進(jìn)行TA克隆需在PCR產(chǎn)物的3'端加一個A，因此對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行加A解育，反應(yīng)體系為0. 1μ1ExTaq，3yllOXExTaqBuffeHTaKaRa)，在 72°C解育半小時。
[0044] 根據(jù)目的片段的特異性來決定是進(jìn)行產(chǎn)物純化還是切膠回收，若目的片段特異， 采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（生工生物），具體方法參見試劑盒說明書。若目的片段不特異， 將產(chǎn)物全部進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳，用手術(shù)刀在紫外燈下進(jìn)行切膠，然后用DNA凝膠回 收試劑盒（生生生物）進(jìn)行回收，具體方法參加試劑盒說明書?；厥胀瓿珊?，取2μ1跑膠 檢測。
[0045] (Ξ)載體連接與轉(zhuǎn)化
[0046] 取適量檢測正確的PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD19-TaaKaRa)進(jìn)行連接，目的片段與 克隆載體的摩爾比控制在3~5:1之間。連接體系包括1μ1 19-Tvector、適量純化后的 PCR產(chǎn)物、5μ1LigationsolutionI(TaKaRa)，加雙蒸水補(bǔ)至10μ1，混勻后在16°C條件下 恒溫連接過夜。
[0047] 將感受態(tài)細(xì)胞D冊α(Vazyme)從-80°C取出并置于冰上融化，將2μ1連接產(chǎn)物加 入到30μ1感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕敲打，冰浴30min，然后于42°C水浴熱擊90s，取出置冰上 穩(wěn)定3min左右后加入不加抗生素的S0C培養(yǎng)基500μ1，37°C震蕩培養(yǎng)比。400化pm離屯、 3min，留下約100μ1上清，用槍頭將菌體重懸浮后涂于含有100μgmliAmp+的LB平板上， 37 °C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。
[0048]用滅菌的牙簽從平板上挑取單菌落接種于含有100μgmliAmp+的LB液體培養(yǎng)基 中，在37 °C恒溫震蕩搖床震蕩培養(yǎng)6~化后，跑菌液PCR檢測陽性克隆。菌液PCR方法為： 在PCR管中加入8μ1水，1μ1菌液混勻后在100°C條件下加熱5min，待恢復(fù)室溫后，往PCR 管里加入 2μ1 10XBuffer，0. 8μ1 2. 5mMdNTPs，0. 2ylrTaq酶，擴(kuò)增條件為 95°C30s， 55°C30s，72°C2min。擴(kuò)增結(jié)束取2μ1產(chǎn)物跑膠檢測，挑取擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小正確的送去 測序（測序委托艾基生物技術(shù)有限公