一種適合bhk-21細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基及其配制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥及生物制品制造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適合BHK-21細胞轉(zhuǎn)瓶 培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基及其配制方法。
【背景技術(shù)】
[0002] BHK-21細胞是世界衛(wèi)生組織和中國生物制品規(guī)程認可的生產(chǎn)疫苗的細胞系，它 具有來源廣，生物安全性高，對多種病毒的感染敏感，病毒增殖滴度高等優(yōu)點。連續(xù)傳代的 BHK-21細胞系可W用于多種病毒的增殖和純化，如口蹄疫病毒，腦必肌炎病毒，呼腸孤病 毒，水瘡性口炎病毒等。中國工業(yè)生產(chǎn)的狂犬疫苗系，口蹄疫疫苗系和偽狂犬疫苗系等全部 或者部分采用BHK-21細胞生產(chǎn)。目前，中國的生產(chǎn)工藝多采用MEM培養(yǎng)基添加10 %的小牛 血清轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)，由于目前中國血清供應(yīng)日益緊張伴隨著價格不斷走高，對中國疫苗生 產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)生了明顯的限制。此外，從生產(chǎn)的角度來講，血清中含有大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)， 送極不利于疫苗、細胞因子和單克隆抗體等生物制品的下游純化分離，同時血清所含的化 學(xué)成分不確定，血清也存在批次穩(wěn)定性問題，而且還容易引起細菌、真菌、病毒和支原體污 染。因此，盡量不用或少用血清成為BHK-21細胞培養(yǎng)的趨勢，現(xiàn)有技術(shù)常通過添加牛血清 白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜島素等動物源成分，來降低血清的添加量，但是動物源成分的蛋白質(zhì) 對生物制品（如疫苗）的安全性有很大影響，所W迫切需要一種適合于BHK-21細胞轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)的低血清低蛋白的培養(yǎng)基，既能夠使細胞快速生長，保持較高的活力，又減少了污染的可 能，提高細胞產(chǎn)品的穩(wěn)定性，同時減少動物來源的蛋白組分含量，利于后期純化工藝，降低 生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種適合BHK-21細胞貼壁生長的 低血清培養(yǎng)基，在常規(guī)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中，血清用量由常規(guī)的10%大幅降低至1%，并且細胞生 長速度更快，所能達到的細胞密度更高，同時保持了較高的活力。培養(yǎng)基研制過程中，用一 些具有特殊功能的化合物、脂類成分、酵母和植物水解物W及重組蛋白代替了培養(yǎng)基中常 規(guī)添加的動物源成分，在降低血清成本的同時，減小了培養(yǎng)基中血清和動物源蛋白攜帶外 源病原菌污染的機率，同時培養(yǎng)基中的蛋白含量大幅減少，十分有利于后期純化工藝，提高 細胞產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
[0004] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是；提供一種適合BHK-21細胞轉(zhuǎn)瓶 培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基，其特征在于，在常規(guī)培養(yǎng)基（DMEM)的基礎(chǔ)上，添加了激素、脂類、微 量元素和水解物成分，用W替代血清的部分功能，用于降低血清的添加量，添加成分及含量 如下：
[0005] 亞砸酸鋼 0. 005-0. 03mg/L;
[000引氨化可的松0. 01-0.Img/L;
[0007]前列腺素 0. 01-0.Img/L;
[000引 Η賄甲狀腺原氨酸0. 001-0.Olmg/L;
[0009] 亞油酸 0. 1-0. 3mg/L;
[0010] 大豆卵磯脂 15-20mg/L;
[0011] 膽固醇 3-lOmg/L;
[0012] 腐胺 0. 04-0. 8mg/L;
[001 引 己醇胺l-20mg/L;
[0014] 棉巧水解物 300-3000mg/L;
[0015] 大米水解物 300-3000mg/L;
[0016] 麥款水解物 300-3000mg/L;
[0017] 丙麗酸鋼 50-300mg/L;
[001引 重組膜島素2-25mg/L;
[0019] 巧樣酸鐵 0. 05-lmg/L;
[0020] 環(huán)庚Η帰酪麗 0.l-6mg/L;
[0021] F-68 100-600mg/L；
[0022] 還原型谷脫甘膚0. 04-0. 5mg/L。
[0023] 利用W上所述成分可W替代血清的部分功能，從而在促進細胞的生長的前提下降 低BHK-21細胞在轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)中血清的添加量。本發(fā)明研制的低血清培養(yǎng)基不僅降低了 培養(yǎng)基成本，而且還大幅減少了培養(yǎng)基中動物源蛋白的含量，更有利于細胞下游產(chǎn)品的分 離和純化。
[0024] 其中前列腺素為前列腺素E1。
[0025] 其中Η賄甲狀腺原氨酸為Η賄甲狀腺原氨酸T3。
[0026] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，編號為Ρ0240。DMEM培養(yǎng)基 為上海源聚生物有限公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基。
[0027] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的另一個技術(shù)方案是一種上述適合ΒΗΚ-21細 胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括如下步驟：
[002引步驟1 ;在容器中加注射用水至總體積的90%，將DMEM培養(yǎng)基全部倒入容器中，用 適量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下并入容器，輕微攬拌溶解；
[0029] 步驟2 ;將上述組分依次加入到溶液中，輕微攬拌溶解；
[0030] 步驟3 ;輕微攬拌至完全溶解，加注射用水至總體積的100% ;
[0031] 步驟4 ;用Imol/L氨氧化鋼溶液或Imol/L鹽酸溶液調(diào)抑至7. 2 ;
[003引步驟5 ;用0. 2μm厚的濾膜正壓過濾除菌；
[0033] 步驟6 ;溶液配制完成后應(yīng)在2°C~8°C下密閉避光保存。
[0034] 其中優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述步驟1中注射用水的水溫為25t：。
[0035] 優(yōu)選的技術(shù)方案還有，所述一袋DMEM培養(yǎng)基的體積為200ml。
[0036] 本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果是，該培養(yǎng)基通過激素、脂類、微量元素、水解物等的添 加，大幅降低了培養(yǎng)基中血清的添加量，即使在血清濃度低至1%的情況下，相比較傳統(tǒng)的 MEM+10%FBSW及市售的低血清培養(yǎng)基MD611+3%FBS，更能促進細胞快速生長，增加細胞 密度，縮短倍增時間，提高細胞活力，說明該發(fā)明培養(yǎng)基更適合于BHK-21細胞的低血清轉(zhuǎn) 瓶培養(yǎng)。
【附圖說明】
[0037] 圖1為實施例2，BHK-21細胞在發(fā)明培養(yǎng)基（JYK-LSM)+1%FBS中的生長情況，A: 細胞生長圖示；B;細胞生長曲線。
[003引 圖2為對照組1，BHK-21細胞在MEM+10%FBS中的生長情況。A;細胞生長圖示； B;細胞生長曲線。
[0039] 圖3為對照組2，BHK-21細胞在MD611+3%FBS中的生長情況。A;細胞生長圖示； B;細胞生長曲線。
【具體實施方式】
[0040] 實施例1
[0041] 本發(fā)明是一種適合BHK-21細胞轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基（JYK-LSM)及其配 制方法，所述培養(yǎng)基是W上海源聚生物科技有限公司生產(chǎn)的P0240培養(yǎng)基（DMEM)作為基礎(chǔ) 培養(yǎng)基添加了無機鹽、激素、脂類、微量元素、水解物等成分，所用材料如無特殊說明均購自 sigma公司，具體添加物及含量如下：
[0042] 亞砸酸鋼 0. 005mg/l，
[0043] 氨化可的松0.Olmg/l，
[0044] 前列腺素E10.Img/l，
[0045] Η賄甲狀腺原氨酸燈3)0.Olmg/l，
[0046] 亞油酸 0.Img/l，
[0047] 大豆卵磯脂15mg/L，
[004引膽固醇3mg/L，
[004引 腐胺 0. 8mg/L，
[0050] 己醇胺 20mg/L，
[0051] 棉巧水解物800mg/l，
[0052] 大米水解物3000mg/L,
[0053] 麥款水解物300mg/l，
[0054] 丙麗酸鋼 50mg/L，
[005引 重組膜島素25mg/L，
[0056] 巧樣酸鐵 0. 05mg/L,
[0057] 環(huán)庚Η帰酪麗6mg/l，
[0058] F-68lOOmg/L,
[0059] 還原型谷脫甘膚0. 04mg/L。
[0060] 實施例2
[0061] 本發(fā)明是一種適合BHK-21細胞轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基（JYK-LSM)及其配 制方法，所述低血清培養(yǎng)基是上海源聚生物科技有限公司生產(chǎn)的P0240培養(yǎng)基（DMEM)作為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加了無機鹽、激素、脂類、水解物等成分，所用材料如無特殊說明均購自sigma 公司，具體添加物及含量如下：
[0062] 亞砸酸鋼 0. 015mg/l，
[0063] 氨化可的松0. 04mg