一種表達融膜蛋白的細胞膜顆粒及其制備和應用
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及合成生物學技術，尤其涉及一種可融合水皰性口炎病毒糖蛋白膜顆粒以及其制備和在傳遞生物大分子和細胞器中的應用。
【背景技術】
[0002]研究發(fā)現(xiàn)，某些疾病，例如苯丙酮尿癥，由于缺乏相關的蛋白酶，導致了患者出現(xiàn)異常癥狀；而另外一些疾病，例如神經(jīng)退行性阿爾茨海默病，俗稱老人癡呆癥，與線粒體功能異常有莫大的關系。雖然，利用藥物投遞系統(tǒng)來實現(xiàn)治療的目的已經(jīng)取得重大的進展，然而，這些系統(tǒng)還不能有效地解決現(xiàn)有問題。
[0003]目前已經(jīng)建立了多種藥物投遞系統(tǒng)，例如，納米顆?？梢酝ㄟ^包裝或者共軛結合的方式實現(xiàn)治療性蛋白質(zhì)和多肽的傳遞，但是，復雜的制作流程、藥物活性的下降、和難以突破內(nèi)體的障礙無不限制著這種系統(tǒng)的廣泛應用；另外，蛋白的傳遞還可以通過外來體(exosome)和微泡(microvesicle)實現(xiàn)，從而克服操作流程繁瑣的問題；而通過水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)納米膜顆粒和利用逆轉錄基質(zhì)蛋白Gag得到的VSV-G類病毒體來傳遞目的蛋白，克服了內(nèi)體的障礙并提高了傳遞的效率。然而VSV-G納米膜顆粒太小，不能包裹更大的物質(zhì)，例如是線粒體，線粒體的大小可以到微米級。
[0004]與生物大分子傳遞系統(tǒng)相比，細胞器傳遞系統(tǒng)進展十分緩慢和有限。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體可以自發(fā)地通過細胞膜納米管道(membrane nanotubles)在細胞之間傳遞，而且能夠恢復線粒體缺陷型細胞的有氧呼吸功能；線粒體顯微注射也可以實現(xiàn)線粒體傳遞，但是嚴格的操作要求和特殊的儀器設備不適用于批量制備；另外，利用放線菌素D (actinomycinD)可以使細胞功能性“去核”，成為含有線粒體的胞質(zhì)體，但是有些細胞不受藥物影響，仍然保留核功能；最近有研究報道，利用細胞穿膜肽(CPP)也可以有效傳遞體外分離的線粒體。但是傳遞效率比較低。
[0005]由于目前傳遞生物大分子和細胞器的投遞系統(tǒng)存在傳遞效率低，費時費力和生物安全性等問題，因此，建立一種高效傳遞生物大分子和細胞器的方法，對于治療多種疾病有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一目的在于提供一種表達融膜蛋白的細胞膜顆粒，可實現(xiàn)生物大分子和細胞器的有效傳遞。
[0007]為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下的技術方案:
一種表達融膜蛋白的細胞膜顆粒，所述細胞膜顆粒在細胞膜上表達水皰性口炎病毒糖蛋白；所述細胞膜顆粒包裹生物大分子和細胞器；所述細胞膜顆粒不具有細胞核、細胞核DNA和核蛋白。水皰性口炎病毒糖蛋白具有融膜功能。包裹生物大分子包括mRNA，microRNA，線粒體DNA，細胞質(zhì)蛋白，細胞膜蛋白等生物大分子。
[0008]進一步的，所述細胞膜顆粒包裹蛋白質(zhì)和線粒體。能夠有效包裹線粒體，并且傳遞到靶細胞中發(fā)揮功能。
[0009]進一步的，所述細胞膜顆粒大小為3Mm~5Mm。在傳遞物質(zhì)過程中，納米顆粒的大小是比較適合傳遞物質(zhì)的，例如是蛋白質(zhì)和一些小分子藥物，而顆粒越大，傳遞的效率會有所下降。但是，納米顆粒大小的缺點是不能包裹更大的物質(zhì)，例如是線粒體，線粒體的大小可以到微米級，為了解決這樣的問題，必須要制備更加大的顆粒，才能有效包裹線粒體。本發(fā)明的細胞膜顆粒為3-5 μ m，雖然在傳遞效率上有所降低，但是可以包裝更多的物質(zhì)，同時保證一定的傳遞效率；而且在膜顆粒上包裹了水皰性口炎病毒蛋白融膜蛋白，提高了膜顆粒進入內(nèi)體后釋放線粒體的效率，從而大大地提高了線粒體的轉遞效率，解決了包裹線粒體的問題，實現(xiàn)高效快速的細胞器的傳遞。
[0010]本發(fā)明的第二目的在于提供一種表達融膜蛋白的細胞膜顆粒的制備方法，包括以下步驟:
(1)用表達水皰性口炎病毒蛋白質(zhì)粒對Ad293細胞進行瞬時轉染；
(2)轉染48h后，用胰酶消化細胞，離心3min后得到懸浮的表達水皰性口炎病毒糖蛋白的細胞；
(3 )將步驟(2 )所得細胞懸液置于針筒，并將針筒安裝到已安置聚碳酸酯膜的針頭式過濾器中，推動針管使細胞懸液從過濾器一邊推出到另外一邊，獲得表達水皰性口炎病毒糖蛋白的細胞膜顆粒。
[0011]胰酶是一種蛋白酶，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞間結合處和細胞-培養(yǎng)皿處蛋白降解，這時細胞由于自身內(nèi)部細胞骨架的張力作用下成為球形，從而使細胞分開。
[0012]進一步的，所述步驟(1)包括以下步驟:
(11)將lmg的表達水皰性口炎病毒蛋白質(zhì)粒加入離心管中，加入50μ 1無血清培養(yǎng)液將混勻；
(12)將3mlPolyjet轉染試劑和50ml的無血清培養(yǎng)液加入另一離心管中，輕輕搖勾；然后加入步驟(12)所得溶液中；得到轉染混合液，室溫靜置5-10min ;
(13)吸去培養(yǎng)液，并補加1ml新鮮無血清培養(yǎng)液，把轉染混合液馬上加入到Ad293細胞，輕輕搖勻；
(14)12h后更換新的培養(yǎng)液。
[0013]Polyjet轉染試劑是一種可生物降解的高分子聚合物的DNA轉染試劑，Polyjet試劑能在電泳期間低濃度固定脫氧核糖核酸迀移，并在5分鐘內(nèi)形成轉染復合體。能夠在轉染聚合物細胞內(nèi)吞后迅速并完全降解聚合物，這樣可大大降低細胞毒性。
[0014]進一步的，每lxlO6的Ad293細胞，用lmg的表達水皰性口炎病毒蛋白質(zhì)粒轉染。
[0015]進一步的，所述聚碳酸酯膜孔徑大小為3μπι ;所述過濾器為25mm可換膜針頭式過濾器。聚碳酸酯膜上面布滿直徑大小為3μπι的圓，有利于形成形態(tài)完整、大小均勻的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒。
[0016]本發(fā)明的第三目的在于提供一種表達融膜蛋白的細胞膜顆粒在傳遞生物大分子和細胞器中的應用。將目的生物大分子和細胞器傳遞到生物大分子和細胞器缺陷的細胞中。表達融膜蛋白的細胞膜顆粒能夠有效包裹線粒體，并且傳遞到靶細胞中發(fā)揮功能?？梢园涯康纳锎蠓肿雍图毎鱾鬟f到生物大分子和細胞器缺陷的細胞中，恢復細胞的正常功能。
[0017]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒顆粒更大，包裹和傳遞更多的物質(zhì)，不但能包裹生物大分子和線粒體，而且在功能上能夠傳遞蛋白質(zhì)和線粒體，并使傳遞的物質(zhì)行使正常的功能。制備時不需要添加額外化學試劑，有效維持了水皰性口炎病毒蛋白的生物活性，制備時采用的Polyjet轉染試劑能在電泳期間低濃度固定脫氧核糖核酸迀移，并在5分鐘內(nèi)形成轉染復合體，所形成的聚合物能夠在轉染聚合物細胞內(nèi)吞后迅速并完全降解聚合物，這樣可大大降低細胞毒性。制備得到的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒的大小均勻、形態(tài)完整。本發(fā)明首次用25_可換膜針頭式過濾器、注射器和孔徑大小為3Mm的聚碳酸酯膜快速方便制備直徑大小約為3 Mm的水皰性口炎病毒蛋白質(zhì)粒細胞膜膜顆粒，這種膜顆?？梢园鞍踪|(zhì)和線粒體，降低蛋白質(zhì)線粒體在體外傳遞過程中的降解，雖然顆粒比納米顆粒更大，但可以包裝更多的物質(zhì)，同時保證一定的傳遞效率；而且在膜顆粒上包裹了融膜蛋白水皰性口炎病毒蛋白，提高了膜顆粒進入內(nèi)體后釋放線粒體的效率，從而大大地提高了線粒體的轉遞效率，這不但為研究生物大分子和細胞器缺陷相關的疾病奠定了基礎，而且對于研究細胞核質(zhì)關系有重要意義。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明表達融膜蛋白的細胞膜顆粒的制備方法示意圖；
圖2為本發(fā)明表達融膜蛋白的細胞膜顆粒的表征圖，其中293/EGFP，293/Mi to，和293/H2B分別表示表達胞質(zhì)綠色熒光蛋白的293細胞，表達線粒體綠色熒光蛋白的293細胞和表達細胞核H2B蛋白和綠色熒光蛋白的融合蛋白的293細胞，最左邊一排圖為細胞拼合圖，其它三排從左到右依次為細胞膜顆粒的明場、綠色熒光蛋白和拼合圖；
圖3為本發(fā)明pLP-VSVG (表達水皰性口炎病毒蛋白)和pDsRed-Expressed (表達紅色熒光蛋白的質(zhì)粒)共轉染Ad293細胞而得到的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒，與Ad293靶細胞孵育后的熒光鑒定圖，a為孵育后5h的熒光照片，b為孵育后12h的熒光照片；
圖4為本發(fā)明pLP-VSVG和pDsRed-Expressed共轉染Ad293細胞而得到的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒的效率統(tǒng)計圖；
圖5為本發(fā)明pLP-VSVG和pCMV (CMC啟動子)_CreER共轉染Ad293細胞而得到的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒，與pCMV-DSRed/l0XP2/DSRed (Loxp系統(tǒng)的報告基因)受體細胞孵育48h后的熒光照片，從左到右分別為DsRed (紅色熒光蛋白)、EGFP (綠色熒光蛋白陽性)和拼合圖；
圖6為本發(fā)明pLP-VSVG和pCMV-CreER共轉染Ad293細胞而得到的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒，與pCMV-DsRed/loxP2/DsRed受體細胞孵育48h后EGFP細胞與DsRed陰性細胞的比例統(tǒng)計鑒定圖；
圖7為本發(fā)明pLP-VSVG和pMito-EGFP (表達能進入線粒體的綠色熒光蛋白)共轉染Ad293細胞而得到的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒，與靶細胞孵育后5h和12h的熒光照片圖8為本發(fā)明pLP-VSVG和pMito-EGFP共轉染Ad293細胞而得到的表達融膜蛋白的細胞膜顆粒傳遞的效率統(tǒng)計圖；
圖9為本發(fā)明去除溴化乙錠(EB)、丙酮酸(pyruvate )、尿苷(uridine )后，線粒體缺陷型細胞HeLa RhoO (線粒體缺陷型)與VSV-G細胞膜顆粒孵育，并在第5天進行線粒體形態(tài)熒光染色鑒定圖，從左到右依次為明場、線粒體染色試劑和拼合圖； 圖10為本發(fā)明去除溴化乙錠(EB)、丙酮酸(pyruvate)、尿苷(uridine)后，線粒體缺陷型細胞HeLa RhoO與VSV-G細胞膜顆粒孵育，并在第5天進行線粒體膜電位熒光染色鑒定圖，從左到右依次為明場、綠色、紅色和拼合圖；
圖11為本發(fā)明去掉溴化乙錠(E