一種中肋骨條藻裂解病毒及其分離方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種藻裂解病毒，尤其是設及一種中肋骨條藻裂解病毒及其分離方法 和應用。
【背景技術】
[0002] 赤潮是被公認的海洋環(huán)境災害，對海洋漁業(yè)生產和海洋生態(tài)平衡表現出很強的破 壞性。赤潮藻體通過水流進入魚類的觸部，造成魚類窒息死亡；有些赤潮藻還分泌毒素，魚 類吞食后，會造成魚類死亡。另外，藻體死亡后，在分解過程中還會消耗水中的大量溶解氧， 致使大量海洋生物因缺氧而死，導致水質惡化，影響水資源的合理利用。目前國內外除藻方 法主要為物理法、化學法和生物法3大類。物理方法成本高，不能從根本上解決營養(yǎng)成分對 藻類的刺激作用；化學除藻劑雖然具有一定效果，可快速殺死藻類，但會產生二次污染，同 時化學藥品的生物富集和放大對整個生態(tài)系統(tǒng)的負面影響較大，長期使用低濃度的化學藥 物會使藻類產生抗藥性，易造成環(huán)境污染甚至破壞生態(tài)平衡。微生物控藻技術是一種生態(tài) 修復技術，其通過強化或減弱系統(tǒng)內藻功能的力度對系統(tǒng)進行調節(jié)，具有經濟性、有效性、 安全性的特點。微生物除藻技術包括病毒除藻、原生動物除藻和細菌除藻3方面。其中，病 毒控藻技術的主要優(yōu)勢在于它能夠強化系統(tǒng)固有生態(tài)功能，其利用浮游生物一一病毒回路 的作用，實現營養(yǎng)物向高營養(yǎng)級的傳遞，恢復生態(tài)系統(tǒng)平衡，同時利用病毒感染的特異性， 可將技術的生態(tài)風險控制到很低水平，因此該技術有良好的發(fā)展前景。
[0003] 中肋骨條藻是一種在全球近岸海域分布極廣的廣溫廣鹽性浮游娃藻，在黃、東、南 海均有該種赤潮記錄，中肋骨條藻已經成為我國赤潮的優(yōu)勢種。2005年9月23-27日，江 蘇海州灣海域赤潮，最大面積為1000km2,主要赤潮生物為中肋骨條藻，直接經濟損失500萬 _7Π〇
[0004] 將藻類病毒很好地應用到赤潮控制中是非常迫切的，也是非常有發(fā)展前景的。自 2004年化gasaki等首次發(fā)現剛毛根管藻病毒W來，迄今已有16株娃藻病毒陸續(xù)被發(fā)現， 但是并未發(fā)現能夠特異性裂解中肋骨條藻的藻病毒。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種中肋骨條藻裂解病毒及其分離方法和應 用，該裂解病毒可安全、高效、快速、特異性的降解海水中中肋骨條藻，使其藻葉綠素a濃度 減少率達76. 14%。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種中肋骨條藻裂解病毒：該 病毒為ScssDNAV株，分類命名為中肋條藻單鏈DNA裂解病毒（Skeletonemacostatum single-strandDMvirus),于2015年5月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCCNo. 10599。
[0007] 該病毒的生物學特征如下：該病毒為球狀，直徑98±2nm，無鞭毛無外膜包被，單 鏈DNA分子；該病毒液分別在20°C中放置兩周、65°C中放置30min，其活性穩(wěn)定；在抑3、 抑10環(huán)境下，其活性穩(wěn)定；在紫外線下處理10分鐘，活性穩(wěn)定；在-80°c中反復凍融1、3、5、 7次，其活性均穩(wěn)定。
[0008] 上述中肋骨條藻裂解病毒的分離純化方法：將含有中肋骨條藻裂解病毒的水域表 層水樣依次經中速濾紙、0. 45μm、0. 22μm濾膜后，經超濾系統(tǒng)濃縮成濃縮水樣，其濃縮倍 數為100倍；將濃縮水樣與指數生長期的中肋骨條藻按體積比1 :4的比例混合后，在恒溫 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為20°C，光照強度2500LX，光暗比12h:12h，得到中肋骨 條藻裂解液；然后經0. 22μm的微孔濾膜過濾取濾液，在濾液中加入PEG6000使其終濃度 達到lOw/v%，4°C冰箱內黑暗下放置過夜，第二天將病毒濾液經4°C，36,OOOg離屯、1.化，去 上清，用含有添加量為30mg/L娃酸鹽的f/2培養(yǎng)基懸浮沉淀即為純化的肋骨條藻裂解病毒 液。
[0009] 上述中肋骨條藻裂解病毒的應用，用于抑制中肋骨條藻生長并殺死中肋骨條藻。
[0010] 其對中肋骨條藻NMBguh004-l、NMBguh004-2株具有強裂解作用。
[0011] 與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明公開了一種中肋骨條藻裂解病毒及 其分離方法和應用，將中肋骨條藻裂解病毒用于控制在特定環(huán)境下由于中肋骨條藻爆發(fā)性 增值或高度聚集而引起的赤潮，此裂解病毒具有高復制率、高感染率的特點，可高效裂解中 肋骨條藻；該病毒具有高特異性，可專一裂解中肋骨條藻，運是保證生態(tài)安全的重要前提； 成本低，病毒的高復制率，培養(yǎng)大量中肋骨條藻裂解病毒較為容易；操作簡單，且不會造成 環(huán)境污染；是一種新型的治理中肋骨條藻赤潮的技術，具有良好的發(fā)展前景。
[0012] 綜上所述，本發(fā)明提供一株中肋骨條藻裂解菌的分離方法和應用，該裂解菌可高 效、快速降解海水中中肋骨條藻，該菌10天能使藻葉綠素a濃度減少76. 14%。
[0013] -種中肋骨條藻裂解病毒：該病毒為ScssDNAV株，分類命名為中肋條藻單鏈DNA 裂解病毒（Skeletonemacostatumsingle-strandDNAvirus),于 2015年 5 月 25 日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCCNo. 10599，，保藏單 位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101。
【附圖說明】
[0014] 圖1為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV負染圖； 圖2為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV經不同抑、溫度、紫外線處理后對中肋骨條藻葉 綠素a的影響； 圖3為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV反復凍融后對中肋骨條藻葉綠素a的影響；圖中 1、3、5、7分別表不凍融1、3、5、7次； 圖4為中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV對中肋骨條藻NMBg址004-2葉綠素a濃度的影 響。
【具體實施方式】
[0015] W下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0016] 一、實驗方法 取5mL藻液，6000g離屯、15min后去上清，加入5mL體積分數為90 %的乙醇水溶液或 者體積分數為90%的丙酬水溶液，在4°C冰箱內避光放置。24h后7000g離屯、lOmin，上 清液用分光光度計檢測在663nm和645nm時的吸光度，用體積分數為90%的乙醇水溶液 或者體積分數為90%的丙酬水溶液調零。藻葉綠素a濃度利用W下公式計算得到：a= (12.7D謝 3-2.59〇645)*ν/Α a代表藻葉綠素a濃度，V為加入的體積分數為90 %的乙醇水溶液或者體積分數為 90%的丙酬水溶液體積，A為藻細胞重量（g)。藻細胞裂解，藻葉綠素a濃度下降。
[0017] 二、具體實施例 實施例1 中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV的分離、純化 表層水樣采自浙江省寧波市寧海雙盤涂水產養(yǎng)殖場，于冰浴下保存，水樣依次經中速 濾紙、0. 45μm、0. 22μm濾膜后，經超濾系統(tǒng)濃縮成濃縮水樣，其濃縮倍數為100倍。
[001引配制濃縮水樣與指數生長期的中肋骨條藻NMBg址004-2按體積比1 :4的比例 混合后，在恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為20°C，光照強度2500LX，光暗比化/ D) 12h: 12h，得到中肋骨條藻裂解液。將不含病毒的濃縮液與處于指數生長期的中肋骨條藻 共培養(yǎng)作為對照組。分別用肉眼、光學顯微鏡、藻葉綠素a濃度變化和電鏡觀察藻生長情 況。
[0019] 選取與對照組相比具有裂解現象的實驗組，經0. 22μπι的微孔濾膜過濾，除去中 肋骨條藻裂解碎片。濾液中加入PEG6000使其終濃度達到10% (質量體積百分比），4°C冰 箱內黑暗下放置過夜。第二天將病毒濾液經4°C，36,OOOg離屯、1.化，去上清，用含有添加量 為30mg/L娃酸鹽的f/2培養(yǎng)基（中肋骨條藻培養(yǎng)基）懸浮沉淀即為純化的病毒液。 W20] 純化的中肋骨條藻裂解病毒該病毒命名為中肋條藻單鏈DNA裂解病毒 (Skeletonema.costatumsingle-strandDNAvirus,ScssDNAV),于 2015年 5 月 25 日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCCNo. 10599。
[0021]其中f/2培養(yǎng)基的成分為：硝酸鋼75mg/l，憐酸二氨鋼5mg/l，六水合Ξ氯化鐵 3. 15mg/l，邸了4-胞2 4. 36mg/l，五水硫酸銅lOmg/L，屯水硫酸鋒22mg/L，六水氯化鉆lOmg/ L，四水氯化儘18mg/l，二水鋼酸鋼6. 3mg/L，維生素Bi2Img/L，維生素ΗImg/L，維生素Bi 200mg/l，加人工海水至IL。 陽0巧實施例2 用光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察肋骨條藻裂解病毒的形態(tài) 取純化的病毒感染中肋骨條藻NMBg址004-2,4d后藻液顏色變淡，光學顯微鏡下觀察 藻細胞，發(fā)現大部分藻細胞裂解。
[0023] 取實施例1所分離純化的中肋骨條藻裂解病毒滴于銅網格上，W2%乙酸軸酷溶 液（W/V)進行負染，再置于電子顯微鏡（日立H-7650)下觀察中肋骨條藻裂解病毒的形態(tài)。
[0024] 結果如圖1所示，中肋骨條藻裂解病毒顆粒系為球狀，直徑98±2nm，無鞭毛無外 膜包被。 陽〇2引實施例3 不同抑、溫度、紫外線W及凍融對中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV穩(wěn)定性的影響 (1)不同抑對中肋骨條藻裂解病毒ScssDNAV穩(wěn)定性的影響 取實施例1分離純化得到的新鮮病毒液2份，測病毒液原始抑值并記錄，隨后用0.