一種利用高溫破壁制備重組酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用高溫破壁制備重組酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著我國(guó)社會(huì)對(duì)環(huán)境保護(hù)要求的提高，以酶工程技術(shù)為核心的綠色化工工藝取得了較多的應(yīng)用。諸如阿托伐他汀、辛伐他汀、孟魯司特、阿扎那韋等等醫(yī)藥化工產(chǎn)品的生產(chǎn)紛紛轉(zhuǎn)向生物催化劑進(jìn)行催化合成來實(shí)現(xiàn)。
[0003]而生物催化劑的生產(chǎn)則通常采用基因工程技術(shù)，以大腸桿菌為宿主，通常借助于強(qiáng)啟動(dòng)子T7，使宿主菌的資源充分用于外源蛋白(重組酶)的表達(dá)。發(fā)酵結(jié)束后，采用離心或膜過濾的方法收集大腸桿菌細(xì)胞，并使細(xì)胞破壁后釋放其中的酶蛋白(重組酶)得到所需的生物催化劑。
[0004]目前，對(duì)于大腸桿菌或重組大腸桿菌進(jìn)行破壁的方法主要有:研磨法:通過在細(xì)菌懸液中加入研磨劑，研磨時(shí)研磨劑顆粒碰撞而破碎細(xì)胞，可用的研磨劑有氧化鋁、玻璃珠、玻璃粉等。超聲波法:利用超聲波對(duì)細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的空穴作用破菌，同時(shí)超聲過程產(chǎn)生的漩渦對(duì)菌體也有剪切力，有助于破菌。壓力法:分為兩種:a.氣壓法，就是對(duì)樣品罐加壓，使菌體內(nèi)壓力增加，然后泄壓，此時(shí)菌體內(nèi)壓力高于外界，菌體自身漲破；b.高壓均質(zhì)機(jī)的破菌過程，細(xì)胞懸液以極快的速度撞擊靜止面，使菌體破碎，這是目前工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多的方法。滲透法:將懸液與高滲透壓液體中平衡，再轉(zhuǎn)移至低滲透壓液體中，此時(shí)大量水分滲入細(xì)胞，使細(xì)胞破裂。凍融法:細(xì)胞內(nèi)胞液凍結(jié)時(shí)產(chǎn)生冰晶，體積增大，撐破菌體。酶解法:分為菌體自溶和溶菌酶兩種方法，菌體自溶可以在大腸桿菌發(fā)酵時(shí)加入低濃度抗生素，干擾胞壁形成，有助于菌自溶，但加入非質(zhì)?？剐缘目股赝蓴_菌的生長(zhǎng)，難以得到較好的結(jié)果。溶菌酶就是水解1，4_糖苷鍵，破壞胞壁中的肽聚糖，對(duì)陽性菌作用較大。對(duì)于陰性菌，因?yàn)榇嬖谥嗵?，必須加入?ΤΑ、去垢劑等以螯合連接相鄰脂多糖的Ca、Mg離子，從而破壞脂多糖。但是，由于種種限制，上述各種破壁方法中，僅氣壓法中的采用高壓均質(zhì)機(jī)破壁法真正用于酶的工業(yè)化制備上。然而高壓均質(zhì)機(jī)破壁法對(duì)設(shè)備依賴嚴(yán)重，高壓均質(zhì)機(jī)價(jià)格高昂易損壞，對(duì)發(fā)酵原料要求也較高，同時(shí)還需要在發(fā)酵結(jié)束后先離心去掉發(fā)酵清液，再重新配制緩沖液將菌體重懸，均質(zhì)破壁后還需要進(jìn)一步離心或超濾去除菌體碎片，最終得到可以應(yīng)用的生物催化劑。該過程對(duì)發(fā)酵原料要求高，對(duì)設(shè)備依賴嚴(yán)重，工序多，廢水多，對(duì)于酶的高效制備，工業(yè)上仍期待有突破性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提出一種利用高溫破壁制備重組酶的方法，解決的問題是如何通過高溫處理對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破壁來提取相應(yīng)重組酶的效果。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的，一種利用高溫破壁制備重組酶的方法，該方法包括以下步驟:
[0007]A、將含有表達(dá)重組酶的重組大腸桿菌接種到經(jīng)過滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，使菌體活化之后再加入誘導(dǎo)劑，然后，再控制溫度在25°C?37°C進(jìn)行低溫發(fā)酵培養(yǎng)；
[0008]B、低溫發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束之后，將溫度升溫至39°C?60°C繼續(xù)進(jìn)行高溫發(fā)酵培養(yǎng)，高溫發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束之后，直接從發(fā)酵液中提取相應(yīng)的目標(biāo)重組酶，得到相應(yīng)的目標(biāo)重組酶。
[0009]本發(fā)明利用高溫破壁制備重組酶的方法，通過在低溫條件下將菌體活化培養(yǎng)成活之后，再加入誘導(dǎo)劑，目的是為了更有效的使外源蛋白(即相應(yīng)的重組酶)得到表達(dá)，使能夠充分利用大腸桿菌中的資源，保證重組酶的產(chǎn)量和效率，相比與現(xiàn)有一般的菌體培養(yǎng)過程基本是將溫度控制在37°C以下的條件下培養(yǎng)至結(jié)束，通過后續(xù)破壁來實(shí)現(xiàn)提取相應(yīng)的外源蛋白(重組酶)，本發(fā)明是直接在培養(yǎng)過程中將溫度升溫繼續(xù)高溫培養(yǎng)，目的是使在細(xì)胞處于較年輕狀態(tài)時(shí)提高溫度來使細(xì)胞壁處于較脆弱的狀態(tài)下加速代謝，從而使在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗到一定程度時(shí)利于細(xì)胞裂解，從而實(shí)現(xiàn)直接在培養(yǎng)過程中就能夠使細(xì)胞壁處于破壁狀態(tài)，達(dá)到破壁的效果。從而避免了收集菌體、采用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破壁的過程，具有工藝簡(jiǎn)潔，廢水量少的優(yōu)點(diǎn)，是一種更為綠色環(huán)保的工藝路線，具有重要的應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)，還能夠保證酶活的性能，實(shí)現(xiàn)既保證提高破壁的效果，降低生產(chǎn)成本，又能夠?qū)崿F(xiàn)高酶活的性能。由于本發(fā)明的主要如何實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞壁的破壁效果，因此，對(duì)于大腸桿菌中的重組酶并沒有具體的限定要求，如所述的含有表達(dá)重組酶的重組大腸桿菌還可以是含有表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶、羰基還原酶、水解酶、異構(gòu)酶或裂解酶等的重組大腸桿菌，同樣能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的效果。上述所述活化培養(yǎng)采用本領(lǐng)域常規(guī)的溫度即可，一般控制溫度在37°C以下進(jìn)行活化培養(yǎng)即可，優(yōu)選，活化培養(yǎng)的溫度控制在25°C?37 °C。
[0010]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優(yōu)選，還包括向發(fā)酵液中加入能夠與目標(biāo)重組酶相互作用的載體進(jìn)行固定化，得到固定化后的重組酶。由于本發(fā)明發(fā)酵結(jié)束之后就能夠?qū)崿F(xiàn)破壁的效果，避免了菌體收集、破壁、酶提取純化等過程，直接離心收集的上清液即可用于相應(yīng)的催化反應(yīng)，具有工藝更簡(jiǎn)潔的效果。
[0011]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優(yōu)選，步驟A中所述含有表達(dá)重組酶的重組大腸桿菌選自含有表達(dá)羰基還原酶的重組大腸桿菌或含有表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶的重組大腸桿菌。
[0012]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優(yōu)選，所述含有表達(dá)重組酶的重組大腸桿菌選自含有表達(dá)His-tag標(biāo)記的羰基還原酶的重組大腸桿菌或含有表達(dá)His-tag標(biāo)記的轉(zhuǎn)氨酶的重組大腸桿菌。通過His-tag標(biāo)記目的是為了有利于后續(xù)相應(yīng)的酶與載體具有更好的連接效果，使實(shí)現(xiàn)更好的固定化作用。
[0013]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優(yōu)選，步驟A中所述含有表達(dá)重組酶的重組大腸桿菌中還含有T7啟動(dòng)子。T7啟動(dòng)子能高效啟動(dòng)下游外源蛋白的表達(dá)。
[0014]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優(yōu)選，步驟A中所述誘導(dǎo)劑選自乳糖或異丙基巰基半乳糖苷。有利于發(fā)酵培養(yǎng)過程中相應(yīng)的重組酶的表達(dá)，使充分利用大腸桿菌中的資源生成相應(yīng)的重組酶，有利于提高收率效果。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述異丙基巰基半乳糖苷的濃度為0.lmmol/L?10mmol/L或所述乳糖的濃度為5?50g/L。通過誘導(dǎo)劑在發(fā)酵液中的濃度優(yōu)化更有利于重組酶的表達(dá)。
[0015]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優(yōu)選，步驟A中所述低溫發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為0.5?8.0小時(shí)。通過控制加入誘導(dǎo)劑后的發(fā)酵時(shí)間，目的是為了控制細(xì)胞壁的生成狀態(tài)，使細(xì)胞處于較年輕的狀態(tài)(即生長(zhǎng)不完全)進(jìn)入高溫狀態(tài)培養(yǎng)，從而使細(xì)胞較脆弱，在高溫狀態(tài)時(shí)就能夠加速代謝，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破壁的效果。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述低溫發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為1.0?4.0小時(shí)。
[0016]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優(yōu)選，步驟B中所述能與目標(biāo)重組酶相互作用的載體選自帶有環(huán)氧基團(tuán)的樹脂、帶有活性醛的樹脂或帶有金屬離子的樹脂。能夠與相應(yīng)的重組酶(酶蛋白)直接作用，將重組酶偶聯(lián)到樹脂上，從而起到更好的固定重組酶的效果。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述帶有環(huán)氧基團(tuán)的樹脂可以選自采用如西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司的Seplite LX-1000EP或Summit PharmaceuticalsInternat1nal的EP113/M等；所述含有活性醛的樹脂如選自經(jīng)戊二醛活化的LX-1000EA或LX-1000HA等；所述含金屬離子的樹脂如用Ni離子或鈷離子活化的S印lite LX-1000