一種能使ctab法提取到真菌高質(zhì)量基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因 組DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA是遺傳信息的載體，是重要遺傳物質(zhì)?；蚪MDNA提取作為分子實驗中基礎(chǔ) 而重要的技術(shù)手段應(yīng)用在各個研究領(lǐng)域。很多研究需要大量實驗材料，一定數(shù)量及高質(zhì)量 的DNA樣品是進行PCR擴增、限制性酶切、Southern雜交、測序等分子生物學(xué)研究的保障。 DNA提取工作量大，而且純度要求高，DNA的提取質(zhì)量和效率嚴重影響實驗結(jié)果。因此，用合 適的方法獲取高質(zhì)高量的DNA顯得極為重要。DNA的提取方法有很多，常用的方法有CTAB 法、SDS法等，運些DM提取方法在原理上基本一致，都是先裂解細胞，再利用有機溶劑進行 多次抽提，使蛋白質(zhì)等沉淀于有機溶劑中，而核酸保留在水相中。由于不同材料在化學(xué)成 分、組織結(jié)構(gòu)等方面的差異，使不同方法對某一具體材料的提取效率差異很大。其中，CTAB 法是一種快速簡便的提取總DM的方法，主要采用機械破碎真菌細胞，然后加入CTAB液分 離緩沖液將DNA溶解出來，再經(jīng)氯仿一異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后得到DNA。對于真菌而 言，其細胞中含有較多的蛋白質(zhì)、糖類、酪類、脂類、色素及其它干擾物，要獲取完整的高質(zhì) 量DNA，需要一種高效穩(wěn)定的方法。因此很多科研工作者都在試圖尋找一種既快速便捷又能 保證基因組DNA質(zhì)量的方法。CTAB及SDS法提取DNA的效果雖還算理想，但也有較大的不 足之處，其中，CTAB法雖然可W有效去除真菌材料中的酪類等雜質(zhì)，但步驟繁瑣，耗時過長， DNA提取量不大，使所獲DNA濃度及純度不夠高，導(dǎo)致后續(xù)實驗的成功率受限。SDS法雖可 快速提取基因組DNA應(yīng)用于分子標記，但提取的DNA僅局限于分子標記等對DNA質(zhì)量要求 不高的實驗，很難滿足對DNA質(zhì)量要求高的分子實驗，如基因克隆、分子雜交等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種能使CTAB法 提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法的技術(shù)方案，該方法能顯著提高DNA的含量、質(zhì)量及得 率，在分子實驗中有應(yīng)用價值。
[0004] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，其特征在于用CTAB 法提取DM的接種時直接用保菌的含目的菌的細沙接種、和/或用配制的抱子懸液均勻涂 板接種后再加入細沙培養(yǎng)、和/或培養(yǎng)的菌絲在提取DNA磨樣時加入細沙磨樣，所有樣品均 需磨樣至菌絲呈現(xiàn)絲滑狀超細粉末時止。
[0005] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，其特征在于用CTAB 法提取DM的接種時直接用保菌的含目的菌的細沙接種、配制的抱子懸液均勻涂板接種后 再加入細沙培養(yǎng)和培養(yǎng)的菌絲在提取DNA磨樣時加入細沙磨樣；具體包括W下步驟： 1)在SDAY平板上鋪上一層滅菌后的玻璃紙，加入80-120化的0. 02%吐溫水，再用含保 有目的菌的60-120目細沙0. 05-0. 12g接種至SDAY玻璃紙上； 2) 再取100化用滅菌后的0. 02%吐溫水配制成的1XΙΟ7個/ml的抱子懸液均勻涂板 接種，然后添加60-120目滅菌后的細沙0.05-0. 12g至接種后的平板上，最后24-26Γ培養(yǎng) 2-3 天； 3) 2-3天后刮取玻璃紙上的菌絲放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，再加入60-120目的滅 菌后的細沙0. 05-0. 12g，然后再加液氮進行快速研磨2-8min至菌絲最終呈現(xiàn)絲滑狀超細 粉末時止，最后按照CTAB法步驟操作，提取過程減少在空氣中暴露，所有離屯、過程使用冷 凍離屯、機在3-5°C下離屯、。
[0006] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，其特征在于CTAB 法提取DNA的接種時用保菌的含目的菌的細沙直接接種包括W下步驟： 1) 在SDAY平板上鋪上一層滅菌后的玻璃紙，加入100-200化的0. 02%吐溫水，再用 含保有目的菌的60-120目細沙0. 1-0. 4g接種至SDAY玻璃紙上用涂棒均勻涂板，C 培養(yǎng)2-3天； 2) 然后刮取玻璃紙上的菌絲放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，加液氮進行快速研磨2-8 min至菌絲最終呈現(xiàn)絲滑狀超細粉末時止，再按照CTAB法步驟操作，提取過程減少在空氣 中暴露，所有離屯、過程使用冷凍離屯、機在4°C下進行。
[0007] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，其特征在于CTAB 法提取DM的抱子懸液涂板后添加細沙方式接種包括W下步驟： 1) 用滅菌后的0. 02%吐溫水配制成1X107個/ml的抱子懸液，取100-200化懸液用 涂棒均勻涂板接種于SDAY平板表面的玻璃紙上，再添加60-120目滅菌后的細沙0. 1-0.4g 至接種的平板上，然后24-26 °C培養(yǎng)2-3天； 2) 然后刮取玻璃紙上的菌絲放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，加液氮進行快速研磨2-8 min至菌絲最終呈現(xiàn)絲滑狀超細粉末時止，再按照CTAB法步驟操作，提取過程應(yīng)盡量減少 在空氣中暴露，所有離屯、過程使用冷凍離屯、機在4°C下離屯、。
[0008] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，其特征在于CTAB 法用培養(yǎng)的菌絲在提取DM磨樣時加入細沙磨樣包括W下步驟： 1) 用含目的菌的細沙和/或配制成的1X1〇7個/ml的抱子懸液接種于SDAY平板表面 的玻璃紙上，24-26°C培養(yǎng)2-3天； 2) 然后刮取玻璃紙上的菌絲放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，加入60-120目的滅菌 后的細沙0.1-0. 4g加液氮進行快速研磨2-8min至菌絲最終呈現(xiàn)絲滑狀超細粉末(約 600-1000目）時止，再按照CTAB法步驟操作，提取過程減少在空氣中暴露，所有離屯、過程使 用冷凍離屯、機在3-5°C下離屯、。
[0009] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，其特征在于步驟1) 中：加入120-180化的0. 02%吐溫水，再加入80-100目含目的菌種的細沙0. 2-0. 3g至 SDAY玻璃紙上用涂棒涂板均勻，25°C培養(yǎng)2. 5天；步驟2)中：研磨時間為3-7min,優(yōu)選 為 4-6min。
[0010] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DM的方法，其特征在于步驟 1)中：取120-160化IX1〇7個/ml抱子懸液涂板均勻后，再添加80-100目滅菌后的細沙 0. 2-0. 3g至平板上，25°C培養(yǎng)2. 5天；步驟2)中：研磨時間為3-7min,優(yōu)選為4-6min。
[0011] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DM的方法，其特征在于步驟1) 中：取120-180化抱子懸液直接用涂棒均勻涂板接種于SDAY平板表面的玻璃紙上，25°C培 養(yǎng)2. 5天；步驟2)中加入80-100目的滅菌后的細沙0. 2-0. 3g加液氮進行快速研磨3-5 min至菌絲最終呈現(xiàn)絲滑狀超細粉末(約600-1000目）時止。
[0012] 所述的一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，其特征在于所述的 真菌為球抱白僵菌、綠僵菌或蛹蟲草等絲狀真菌。
[0013] 上述一種能使CTAB法提取到真菌高質(zhì)量基因組DNA的方法，可W顯著提高提取 的DNA的含量，并且對DNA的品質(zhì)及得率都有顯著提高，適用性很強。該方法操作方便，實 驗穩(wěn)定性強，可重復(fù)性高，快捷實用，在保證DNA提取質(zhì)量的同時，可節(jié)省磨樣時間，即使大 量提取DNA樣品時也同樣有較高的磨樣速率，一般在2-8min內(nèi)就可W完成磨樣，顯著縮短 磨樣時間，減輕磨樣疲勞度，提高樣本提取的成功率。而且，提取的DNA經(jīng)濃度、純度檢測、 PCR擴增、片段克隆、聚丙締酷胺凝膠電泳等分子實驗驗證，均表明利用本方法提取的基因 組DNA從濃度、純度、質(zhì)量完全可應(yīng)用于需要DNA的分子實驗，如分子雜交、基因克隆及分子 標記等。
[0014] 本申請文件中設(shè)及的百分含量除另有說明外，其余均為純物質(zhì)的重量百分依含 量。
【附圖說明】
[0015]圖1為實施例1-3提取的基因組凝膠電泳檢測結(jié)果；實施例1:泳道1-3 ;實施例 2:泳道4-6;實施例3:泳道7-9;M:markerIV;對照ck:泳道11-13; 圖2為實施例4-6提取的基因組凝膠電泳檢測結(jié)果；實施例4 :泳道1-3 ;實施例5 :泳 道 5-7 ;實施例 6 :泳道 9-11;M:markerIV;對照ck:泳道 13-15。
【具體實施方式】
[0016] 下面再結(jié)合具體實施例和對比試驗對本發(fā)明作進一步的說明。
[0017] 實施例1 用滅菌后的0. 02%吐溫水配制成1X107個/ml的抱子懸液，取100化懸液直接用涂 棒均勻涂板接種于SDAY平板表面的玻璃紙上，25°C培養(yǎng)2. 5天。然后刮取玻璃紙上的菌絲 放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，加入60目的滅菌后的細沙0. 3g加液氮進行快速研磨3min 至菌絲最終呈現(xiàn)絲滑狀超細粉末（600-1000目）時止，再按照CTAB法步驟操作，提取過程盡 量減少在空氣中暴露，所有離屯、過程使用冷凍離屯、機在4°C下離屯、。
[001引實施例2 用滅菌后的0. 02%吐溫水配制成1X107個/ml的抱子懸液，取150化懸液用涂棒均勻 涂板接種于SDAY平板表面的玻璃紙上，再添加70目的滅菌后的細沙0. 1g，25°C培養(yǎng)2. 5 天。然后刮取玻璃紙上的菌絲放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，加液氮進行快速研磨4min至 菌絲最終呈現(xiàn)絲滑狀超細粉末（600-1000目）時止，再按照CTAB法步驟操作，提取過程盡量 減少在空氣中暴露，所有離屯、過程使用冷凍離屯、機在4°C下離屯、。
[001引實施例3 在SDAY板上鋪上一層滅菌后的玻璃紙，加入120μL的0. 02%吐溫水，再加入80目適 量（0. 2g)含目的菌種的細沙至SDAY玻璃紙上用涂棒涂板均勻；25°C培養(yǎng)3天。然后刮取 玻璃紙上的菌絲放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，加液氮進行快速研磨5min至菌絲最終呈現(xiàn) 絲滑狀超細粉末（600-1000目）時止，再按照CTAB法步驟操作，提取過程盡量減少在空氣中 暴露，所有離屯、過程使用冷凍離屯、機在4°C下離屯、。
[0020] 實施例4 在SDAY板上鋪上一層滅菌后的玻璃紙，加入150μL的0. 02%吐溫水，再加入120目適 量（0. 15g)含目的菌種的細沙至SDAY玻璃紙上用涂棒涂板均勻，25°C培養(yǎng)2天。然后刮取 玻璃紙上的菌絲放入-70°C冰箱預(yù)冷的研鉢中，加入液氮進行快速研磨6min至菌絲最終呈 現(xiàn)絲滑狀超細粉末時止，再按照CTAB法步驟操作，提取過程盡量減少在空氣中暴露，所有 離屯、過程使