直接提取牛奶中3種致病菌dna的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種直接提取牛奶中3種致病菌DNA的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]乳房炎是奶牛場中最普遍也是造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一，該病引起牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)降低，治療成本大大提高，奶牛過早淘汰，制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)、乳品加工業(yè)的健康發(fā)展，危害公共衛(wèi)生安全及人類健康，如何有效預(yù)防和控制該病已成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0003]病原細(xì)菌感染是引起該病的最主要原因，其中以大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、無乳鏈球菌(S.agalac tiae)這三種病原菌為主要致病菌。致病菌的檢測是乳房炎防控的前提條件，目前診斷奶牛乳房炎致病菌的方法基于牛奶中的微生物的培養(yǎng)和細(xì)菌生化試驗(yàn)，一方面工作量大，另外一方面耗時(shí)長。由于細(xì)菌培養(yǎng)方法的局限性，PCR方法已經(jīng)得到了較為廣泛的研究與應(yīng)用，它大大提高了診斷奶牛乳房炎致病菌的效率，而DNA模板的制備直接影響到了 PCR方法檢測的速度與敏感性，通常直接從牛奶中分離純度較高的目標(biāo)致病菌的DNA是很難的，一般需要通過選擇性增菌培養(yǎng)過程，這雖然提高了檢測的敏感性，卻大大降低了檢測的速度。
[0004]近年來報(bào)道的直接提取牛奶中細(xì)菌DNA的方法，存在步驟繁雜、費(fèi)時(shí)，需要昂貴的試劑及毒性等不足，限制了這些方法的推廣與應(yīng)用。因此，迫切需要建立一種便捷的從牛奶中提取乳房炎致病菌DNA的新方法，以便于配合早期診斷，為乳房炎診斷爭取寶貴的時(shí)間，避免因診斷耗時(shí)而造成的進(jìn)一步經(jīng)濟(jì)損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、方便、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、無污染的直接提取牛奶中3種致病菌DNA的方法及試劑盒，適用于受奶牛乳房炎病原細(xì)菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌污染的牛奶樣品的DNA提取。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:直接提取牛奶中3種致病菌DNA的試劑盒，主要包括溶液A，溶液A的組成為62.5_375mM EDTA_2Na、82.43-494.58mMNaOH(片狀)、0.083-0.5% SDS、233mM NaCl。
[0007]溶液A 的組成為 323mM EDTA_2Na、426mM Na0H、0.1834% SDS、233mM NaCl。
[0008]上述直接提取牛奶中3種致病菌DNA的試劑盒還包括溶液B，溶液B的組成為NaC18g/L、KC1 0.2g/L、ΚΗ2Ρ040.24g/L、Na2HP04.12H20 3.63g/L，用濃鹽酸調(diào) pH 至 7.4。
[0009]上述直接提取牛奶中3種致病菌DNA的試劑盒，還包括溶液C、EP管(1.5mL)和滅菌棉簽，溶液C為滅菌雙蒸水。
[0010]使用上述試劑盒直接提取牛奶中3種致病菌DNA的方法，3種致病菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌。
[0011]上述直接提取牛奶中3種致病菌DNA的方法，包括以下步驟:
[0012](1)取400 yL牛奶和600 yL溶液A，于1.5mL EP管中，充分混合；65 °C溫浴
0-15min，充分混勻；微波功率700W，開蓋微波3min，充分混勻；
[0013](2)在12000r/min、4°C條件下，離心8min，棄上層，并用溶液B浸潤滅菌棉簽后，小心擦拭附著在管壁上的乳脂；
[0014](3)加0.25-1.5mL溶液B，充分混勻，在10000r/min、4°C條件下，離心lOmin，棄上清。
[0015]步驟⑴中溫浴時(shí)間為6min，步驟(3)中溶液B為lmL。
[0016]上述的直接提取牛奶中3種致病菌DNA的方法，還包括以下步驟:
[0017](4)加35 μ L溶液C，充分混勻，直接用于PCR或者_(dá)20°C保存。
[0018]針對現(xiàn)有牛奶中致病菌DNA提取方法存在的不足，發(fā)明人研發(fā)了一種直接提取牛奶中3種致病菌DNA的試劑盒，主要包括溶液A，溶液A的組成為62.5_375mM EDTA_2Na、82.43-494.58mM Na0H、0.083-0.5% SDS、233mM NaCl。該試劑盒試劑成分簡單，無需用到溶菌酶、蛋白酶K，也沒有用到毒性較大的苯酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑，成本低廉、操作簡便?；诰脑O(shè)計(jì)的提取液并結(jié)合微波法，發(fā)明人還建立了一種直接提取牛奶中3種致病菌DNA的方法，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌。該法改善了裂解細(xì)胞效果，同時(shí)簡化了常規(guī)提取步驟，牛奶處理過程僅需在1個(gè)EP管中進(jìn)行，整個(gè)提取過程縮短至30min內(nèi)，所得模板可直接用于PCR反應(yīng)，再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即可完成在短時(shí)間內(nèi)對樣品的檢測。
[0019]本發(fā)明的主要原理是:溶液A中含有EDTA、NaOH、SDS和NaCl，首先將牛奶和溫浴過的溶液A充分混合后，經(jīng)較高溫度(65°C)溫浴一段時(shí)間后，有利于SDS裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞核酸，同時(shí)使蛋白變性；NaOH使溶液A處于堿性環(huán)境利于EDTA溶解和細(xì)胞膜的變性。接著，在微波條件下，原本難裂解的革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁被裂解而釋放核酸。NaCl溶液的終濃度為0.14M時(shí)DNA的溶解度最小。EDTA是二價(jià)金屬離子的螯合劑，可結(jié)合鈣離子和鎂離子，能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解，且EDTA可降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，與SDS協(xié)作下，更有利于DNA的提取。在低溫高速離心條件將DNA沉淀，并將蛋白質(zhì)，油脂，金屬離子等分離。溶液B為洗滌液即PBS緩沖液，可洗滌上一步殘留的油脂和溶液A，最后用滅菌雙蒸水將DNA溶解。
[0020]本發(fā)明為配合快速PCR檢測乳房炎病原菌提供了有效的手段。應(yīng)用其進(jìn)行牛奶致病菌DNA提取，具有比常規(guī)提取方法更便捷、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，適合實(shí)際操作，具有顯著的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。
【附圖說明】
[0021]圖1是3種方案直接提取牛奶中3種致病菌DNA的PCR電泳圖，圖中:M是Marker ;
1-3為方案一，4-6為方案二，7-9為方案三，其中1、4、7泳道為大腸桿菌；2、5、8泳道為金黃色葡萄球菌；3、6、9泳道為無乳鏈球菌；10為陰性對照。
[0022]圖2是應(yīng)用本發(fā)明提取大腸桿菌的敏感性PCR電泳圖，圖中:Μ是Marker ;1_8分別對應(yīng)不同濃度的大腸桿菌，依次為4X 107、4X 106、4X 105、4X 104、4X 103、4X 102、4X 101、4X10°CFU/mL ;9陽性對照模板DNA ；10無細(xì)菌乳樣陰性對照。
[0023]圖3是應(yīng)用本發(fā)明提取金黃色葡萄球菌的敏感性PCR電泳圖，圖中:M是Marker ;1-8分別對應(yīng)不同濃度的金黃色葡萄球菌，依次為2.5X10S、2.5X107、2.5X106、2.5X105、2.5X 104、2.5X ΙΟ3、〗.5X ΙΟ2、〗.5X lO'CFU/mL ；9陽性對照模板DNA ；10無細(xì)菌乳樣陰性對照。
[0024]圖4是應(yīng)用本發(fā)明提取無乳鏈球菌的敏感性PCR電泳圖，圖中:Μ是Marker ;1_8分別對應(yīng)不同濃度的無乳鏈球菌，依次為7Χ10γ、7Χ106、7Χ105、7Χ104、7Χ103、7Χ102、7X10\7X10°CFU/mL ;9陽性對照模板DNA ；10無細(xì)菌乳樣陰性對照。
[0025]圖5是本發(fā)明提取方法的穩(wěn)定性PCR電泳圖，圖中:M是Marker ;1_7為大腸桿菌；8-14為金黃色葡萄球菌；15-21為無乳鏈球菌；22為陰性對照。
[0026]圖6是應(yīng)用本發(fā)明提取方法添加不同體積溶液A時(shí)，提取含等量金黃色葡萄球菌的奶樣和肉湯的PCR電泳圖，圖中:Μ是Marker ;1_8為含金黃色葡萄球菌奶樣，分別對應(yīng)不同體積溶液A，依次為0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2,0.lmL ;9_16為含金黃色葡萄球菌肉湯，分別對應(yīng)不同體積溶液A，依次為0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2,0.lmL ；17為陰性對照。
[0027]圖7是應(yīng)用本發(fā)明提取多種微生物DNA的PCR電泳圖，圖中:M是Marker ;1_8分別為錯(cuò)樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、普通變形桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、白色念珠菌；9為陰性