Dna條形碼結(jié)合二代高通量測(cè)序快速鑒別a型流感病毒亞型的引物組和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種DNA條形碼結(jié)合二代高通量測(cè)序快速鑒別A型流感病毒亞型方法 用的引物組和方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 根據(jù)流感病毒表面糖蛋白血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶（NA)的抗原性差異，A型流感 病毒可分為18種HA亞型和11種NA亞型。但由于病毒依賴于RNA的RNA聚合酶缺少校對(duì) 功能，導(dǎo)致其在復(fù)制過程中基因組的突變率較高。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)已新發(fā)現(xiàn)包括H10N8、 冊(cè)肥、H7N9在內(nèi)的Ξ種新發(fā)亞型禽流感病毒的感染，每年爆發(fā)的數(shù)量和季節(jié)性的差異也表 明流感在不同宿主間交叉?zhèn)鞑ヒ灿宇l繁。而傳統(tǒng)的基于核酸擴(kuò)增的鑒定手段往往不能快 速的給予核酸信息，給病毒的全面準(zhǔn)確檢測(cè)帶來了極大的挑戰(zhàn)。
[0003] 目前，二代高通量測(cè)序技術(shù)越來越廣泛用于病原基因的分析，是大規(guī)模監(jiān)測(cè)病毒 基因組進(jìn)化的重要手段。在流感病毒的研究上，傳統(tǒng)方法分析鑒定病毒通常采用化ffmann 等設(shè)計(jì)的方法擴(kuò)增流感病毒基因組全長(zhǎng)，或者W病毒特異引物擴(kuò)增分型基因片段，進(jìn)行 Sanger法克隆測(cè)序，該方法耗時(shí)長(zhǎng)，勞動(dòng)力成本高，不適合大規(guī)模檢測(cè)使用。而二代高通量 測(cè)序不需要大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行DNA模板擴(kuò)增。其基本測(cè)序方法是將基因組DNA隨機(jī)切割成 小片段DNA分子，然后在體外給運(yùn)些小片段分子的末端連接上接頭制成文庫避免了Sanger 測(cè)序法所需的繁瑣克隆過程。同時(shí)，DM條形碼技術(shù)的便捷性大大適應(yīng)了二代測(cè)序技術(shù)的 發(fā)展，可無需擴(kuò)增全長(zhǎng)進(jìn)定，且引物使用簡(jiǎn)單，只需通過使用一段標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，在二代測(cè) 序技術(shù)的輔助下，即可通過測(cè)序獲取相應(yīng)的型別信息。
[0004] 研究人員曾用col基因鑒別出了含禽流感病毒的26種野生鳥類，能準(zhǔn)確的識(shí)別鳥 類宿主禽流感病毒的脫落、研究候鳥流感流行病學(xué)的規(guī)律和宿主種群生態(tài)學(xué)。但對(duì)病毒亞 型本身的條碼技術(shù)開發(fā)尚未見相應(yīng)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題利用DNA條形碼理念，尋找A型流感病毒適合的條形 碼序列，一方面足夠保守能夠利用條碼引物進(jìn)行A型流感病毒的大范圍擴(kuò)增，另一方面具 備足夠的變異能夠區(qū)分密切相關(guān)的亞型。同時(shí)對(duì)擴(kuò)增的條碼片段進(jìn)行高通量測(cè)序技術(shù)，W 開發(fā)更加廣譜、便捷的通用流感分型檢測(cè)技術(shù)。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供了DNA條形碼結(jié)合二代高通量測(cè)序快速鑒別A型流感病毒亞型方法用 的引物組，引物序列如下：
[0008] (1)
[0009] HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA
[0010] HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA
[0011] 似
[0012] NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR
[0013]NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR〇
[0014] 利用上述本發(fā)明提供的引物組，還提供一種DM條形碼結(jié)合二代高通量測(cè)序快速 鑒別A型流感病毒亞型的方法，包括下列步驟：
[0015] (1)基因組提取及反轉(zhuǎn)錄 [001引 （2)引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增
[0017] (3)IonTorrent測(cè)序
[0018] (4)生物信息學(xué)分析
[0019] (5)系統(tǒng)進(jìn)化分析與遺傳距離計(jì)算。
[0020] 所述的基因組提取及反轉(zhuǎn)錄具體步驟為：
[0021] 按QIAGenRNA提取試劑盒操作步驟提取RNA，每份病毒RNA樣品溶解于50μL的 RNase水，12000巧m離屯、2min，立即開始反轉(zhuǎn)錄，WU125' -過gc過過過過gc過gg-3 > 為引物，參照 TaKaRa公司1ststrandcDNASynthesisKitcDNA試劑盒使用說明加入試劑，RT反應(yīng)條 件為：30°C10min，42°C40min，7(TC15min，-8(TC保存。
[0022] 所述的引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增具體步驟為：
[002引在NCBI流感病毒庫中，下載16種HA亞型和9種NA亞型的全長(zhǎng)序列，同一區(qū)域同 一年代只選一株為代表，設(shè)計(jì)DNA條形碼引物，設(shè)計(jì)的引物和預(yù)期目的片段大小具體見下 表：
[0024]
[00巧]利用HA條碼引物進(jìn)行PCR，設(shè)置程序?yàn)椋?4°C2min，30個(gè)循環(huán)怕4°Clmin，52°C，Imin, 72°C3min}，68°ClOmin；
[0026] 擴(kuò)增NA基因的保守條碼片段，因擴(kuò)增產(chǎn)物G+C含量百分比不同，退火溫度會(huì)有差 異，故PCR反應(yīng)采用touch-down程序：
[0027] 94°C2min；
[0028] 怕4°C30S，53°C30S每個(gè)循環(huán)遞減rC直到45°C;68°C45幻；8個(gè)循環(huán)
[0029]怕4°C30S，50°C30S，68°C45幻；30 個(gè)循環(huán)
[0030] 68°ClOmin；
[0031] -20°C保存。
[0032] 所述的IonTorrent測(cè)序具體步驟為：
[0033] 上述樣本全部擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行電泳鑒定，用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。分別取 lOOng純化產(chǎn)物，HA擴(kuò)增產(chǎn)物用Ion Shear? Plus Reagent Kit進(jìn)行酶切打斷5min(因測(cè)序 范圍足夠，ΝΑ擴(kuò)增產(chǎn)物不需酶切），酶切產(chǎn)物需加入1. 8倍體積AMPure" XP Beads純化，然后 HA擴(kuò)增產(chǎn)物加入Ion X press? Barcode 1接頭，ΝΑ擴(kuò)增產(chǎn)物加入Ion X pressTM Barcode 2接頭，E-Gel膠選擇片段（約33化p)構(gòu)建文庫。用P]atimun。PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行文庫擴(kuò) 增，Ion Library TaqMan" qPCR Mix鑒定文庫質(zhì)量。取70 μ L終濃度為50pmol/ μ L的工作 文庫Ion化ef System上機(jī)，進(jìn)行油包水PCR和堿裂解法制備單鏈模板，最后將帶有模板 的微粒溶液自動(dòng)點(diǎn)樣至314忍片中，上機(jī)Ion torrent PGM進(jìn)行高通量測(cè)序。
[0034] 所述的生物信息學(xué)分析具體步驟為：
[0035] 上機(jī)測(cè)序后經(jīng)PGM測(cè)序儀自動(dòng)運(yùn)行得到的測(cè)序結(jié)果，解析為sff格式的原始文件 fastq格式的測(cè)序序列數(shù)據(jù)。將化stq格式的測(cè)序序列進(jìn)行過濾，篩除低質(zhì)量序列、過段序 列及錯(cuò)誤序列。選取GenBank中批量下載的各亞型流感病毒HA\NA全基因序列作為參考序 列，將測(cè)序數(shù)據(jù)使用化C Genomic Worbench軟件比對(duì)到參考序列中，通過覆蓋參考序列的 序列數(shù)量、比例W及參考序列被覆蓋的長(zhǎng)度判斷樣品中是否有對(duì)應(yīng)亞型的病毒。
[0036] 所述的系統(tǒng)進(jìn)化分析與遺傳距離計(jì)算具體步驟為：
[0037] 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將測(cè)定的序列與GenBank中參考序列在MEGA5.0的化AST中比 對(duì)，除去兩條引物之外的序列，基于鄰接法（nei曲bor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹， 并且計(jì)算遺傳距離。運(yùn)算次數(shù)為1000，核酸替換模型為采用國(guó)際提倡的K-2P，K2P距離與P 距離相比考慮了轉(zhuǎn)換和顛換的替代率，是在變異很小時(shí)區(qū)分物種的最佳模型也是生物條形 碼聯(lián)盟推薦使用的距離計(jì)算模型。
[0038] 本發(fā)明的有益效果：
[0039] 極其多樣的流感病毒亞型廣泛存在于我們周圍的環(huán)境和動(dòng)物體內(nèi)，其中很多亞型 種類為人類所未知，而發(fā)現(xiàn)未知病毒亞型常常受制于病毒常規(guī)檢測(cè)技術(shù)的局限性。傳統(tǒng)的 流感病毒測(cè)序，通常采用HA、NA基因的特異引物獲取相應(yīng)亞型的基因片段，進(jìn)行克隆，選擇 陽性克隆進(jìn)行Sanger法測(cè)序，然后進(jìn)行序列的比對(duì)，方法操作比較繁瑣、費(fèi)時(shí)，而且需要大 量的優(yōu)化，產(chǎn)物得率較低且雜帶較多，不適于實(shí)際的常規(guī)監(jiān)測(cè)或診斷。自從2005年高通量 測(cè)序儀問世W來，高通量測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，從通量到讀長(zhǎng)得到了極大的改善，具有標(biāo)準(zhǔn)化 流水作業(yè)的文庫構(gòu)建流程，避免了常規(guī)試驗(yàn)中的細(xì)菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)W及單克隆的挑選，而且短 時(shí)間內(nèi)可W獲得大量有效的數(shù)據(jù)。
[0040] 本發(fā)明通過對(duì)16種不同地域和亞型的A型流感病毒材料的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了 可區(qū)分各亞型的DNA條碼。研究人員曾提出利用條形碼序列有效進(jìn)行鑒別的關(guān)鍵點(diǎn)是種間 的遺傳距離必須大于種內(nèi)，且距離差異大約為10倍。本發(fā)明中的HA型間平均遺傳距離為 0. 550,高于型內(nèi)平均遺傳距離0. 032。NA型間平均遺傳距離為0. 585,均高于型內(nèi)遺傳距離 0. 150。分析系統(tǒng)樹顯示，各亞型均能自成一支形成單系。
[0041] 本發(fā)明利用DNA條形碼技術(shù)思路，采用傳統(tǒng)RT-PCR檢測(cè)方法，優(yōu)選touch-down程 序可W快速判定有無流感病毒，并能同時(shí)測(cè)定A型流感病毒的亞型及致病型，是一種更簡(jiǎn) 單，更快速流感分型診斷程序。
【附圖說明】：
[0042] 圖1是包含16種HA亞型的16株不同實(shí)驗(yàn)株HA條碼區(qū)段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。Μ DNAMarkerDL2000;l.Η1Ν1;2.肥Ν9;3.冊(cè)Ν8;4.Η4Ν1;5.冊(cè)Ν1;6.冊(cè)Ν5;7.Η7Ν2; 8.冊(cè)Ν4;9.Η9Ν2;10.Η10Ν7;11.Η11Ν6. ;12.Η12Ν5;13.Η13Ν6;14.Η14Ν5;15.Η15Ν8; 16.Η16Ν3。
[0043] 圖2是包含9種ΝΑ亞型的16株不同實(shí)驗(yàn)株的ΝΑ條碼區(qū)段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。從 左到右依次為MarkerDL2000;l.Η1Ν1;2.Η4Ν1;3.冊(cè)Ν1;4.Η7Ν2;5.冊(cè)Ν2;6.Η16Ν3; 7.冊(cè)Ν4;8.冊(cè)Ν5;9.Η12Ν5;10.Η14Ν5;11.Η11Ν6;12.Η13Ν6;13.Η10Ν7;14.Η3Ν8;15.Η15Ν8;16.肥N9;MarkerDL2000。
[0044] 圖3是HA核酸文庫及不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增曲線。1:6. 8ρΜ標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 2:0. 68ρΜ標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線3:0. 068ρΜ標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線ΗΑ:目標(biāo)檢測(cè)文庫擴(kuò)增曲線。
[004引圖4是ΝΑ核酸文庫及不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增曲線。1:6. 8ρΜ標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 2:0. 68ρΜ標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線3:0. 068ρΜ標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線ΝΑ:目標(biāo)檢測(cè)文庫擴(kuò)增曲線。
[0046] 圖5是IonTorrent測(cè)序儀讀取序列數(shù)。
[0047] 圖6是HA亞型間遺傳距離。
[0048] 圖7是NA亞型間遺傳距離。
【具體實(shí)施方式】：
[0049] 本實(shí)施例提供一種利用DNA條形碼結(jié)合二代高通量測(cè)序快速鑒別A型流感病毒亞 型方法。
[0050] 1材料和方法
[0051] 1. 1毒株材料（09p血豬流感H1N1，馬流感冊(cè)N8,禽流感肥N9、H4N1、冊(cè)N1、H7N2、 H9N2、H13N6、H16N3)滅活樣本由本實(shí)驗(yàn)室保存，冊(cè)N5、冊(cè)M、H10N8、H11N6、H12N5、H14N5、 H15N8核酸樣本由吉林出入境檢疫檢疫局惠贈(zèng)（詳見下表）
[0052]

[0053] 1. 2 分子生物學(xué)試劑Agencou:rt*AMPure*XPReagent為Thermo公司產(chǎn)品；foieasy MiniKit為QIAGen公司產(chǎn)品；1ststrandcDNASynthesisKitcDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 ΕΧ-Taq聚合酶、SolutionI連接酶、AgaroseGelDMExtrationKit試劑盒購自TaKaRa 公司；IonShear?PlusReagentKit、IonXpress?BarcodeX、PlatimurrPCRSuperMix、 LibraryAmplificationPrimerMix、IonLibrary'妨娜站fqPCRMix試劑盒均為L(zhǎng)ife Technologies公司產(chǎn)品。
[0054] 1. 3主要儀器StepOnePLUS巧光PCR儀購自ABI公司。IonChefSystem核