一種精確定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系t25的試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的試劑盒及檢測(cè)方法，屬分子生物 學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著轉(zhuǎn)基因作物在全世界范圍內(nèi)的廣泛種植，其食用安全和環(huán)境安全問(wèn)題一直受 到廣大消費(fèi)者、各國(guó)政府及相關(guān)國(guó)際組織的高度重視。很多國(guó)家和地區(qū)紛紛制訂了轉(zhuǎn)基因 生物安全管理法規(guī)，實(shí)施標(biāo)識(shí)制度。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年1月5日，發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生 物標(biāo)識(shí)管理辦法》，規(guī)定在中國(guó)境內(nèi)銷(xiāo)售列入目錄的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)當(dāng)有明顯的標(biāo)識(shí)。 今年10月份實(shí)施的新《食品安全法》又進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因食品作出了必須"顯著標(biāo)示"的明 確規(guī)定，運(yùn)必然會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)提出更高的需求。然而不同于歐盟（標(biāo)識(shí)闊值0.9)、 澳大利亞（標(biāo)識(shí)闊值1. 0)、韓國(guó)（標(biāo)識(shí)闊值3. 0)、日本（標(biāo)識(shí)闊值5. 0)等國(guó)家，我國(guó)尚未 出臺(tái)轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)闊值法規(guī)，采取定性標(biāo)識(shí)即零闊值，運(yùn)與我國(guó)現(xiàn)行的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)主要是W 定性方法為主，缺乏可W定量的標(biāo)準(zhǔn)方法不無(wú)關(guān)系。因此，研究建立轉(zhuǎn)基因精準(zhǔn)定量檢測(cè)方 法，可為我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標(biāo)識(shí)和闊值管理奠定基礎(chǔ)，推動(dòng)與國(guó)際接軌，并為維護(hù)國(guó)際貿(mào) 易中的國(guó)家利益提供技術(shù)保障。
[0003] 食品中轉(zhuǎn)基因成分的含量通常是W轉(zhuǎn)入基因與內(nèi)源基因的數(shù)量之比來(lái)表示的， 實(shí)時(shí)巧光PCR(qPCR)是現(xiàn)今國(guó)際上通用的定量檢測(cè)方法。該方法利用巧光信號(hào)的變化實(shí) 時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)對(duì)梯度稀釋的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Certified ReferenceMaterials,CRM)的檢測(cè)，分別獲得內(nèi)源和外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而通過(guò)循環(huán)闊 值（Ct)計(jì)算得到待測(cè)樣品中內(nèi)源和外源基因的含量?？梢?jiàn)，樣品中核酸擴(kuò)增的抑制成分、 實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作者的技能等都會(huì)直接影響擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量，從而干擾定量的準(zhǔn) 確性。
[0004] 近年來(lái)新興起的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)（化opletdigitalPCR，ddPCR)，通過(guò)把稀釋 到一定濃度的DM分子分布到10000~20000個(gè)微滴中，使大部分微滴中DM分子的數(shù)量 為1或0,然后通過(guò)PCR擴(kuò)增和陽(yáng)性信號(hào)的累積來(lái)讀取陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)，再根據(jù)泊松分布計(jì) 算出樣本中的DNA分子拷貝數(shù)。當(dāng)前，利用ddPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)尚處于起步階段，研 究報(bào)道數(shù)量不多，主要是針對(duì)MonSlO轉(zhuǎn)基因玉米，對(duì)其余轉(zhuǎn)基因品系定量檢測(cè)的有效性和 實(shí)用性尚未可知，開(kāi)發(fā)空間和應(yīng)用前景廣闊。
[0005] 轉(zhuǎn)基因玉米是全球種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因作物之一，選取其中具有代表性的品系 T25為研究對(duì)象，分析其基因構(gòu)成，選擇合適的內(nèi)外源基因組合，設(shè)計(jì)出高度特異的引物和 探針，建立適用于T25轉(zhuǎn)基因定量的雙重ddPCR檢測(cè)方法。經(jīng)特異性、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍、L0D、 L0Q、準(zhǔn)確性和重復(fù)性驗(yàn)證，證明該方法滿(mǎn)足了國(guó)際上對(duì)轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)的技術(shù)要求，從而 為其他轉(zhuǎn)基因作物的精準(zhǔn)定量研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一組用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的引物和探 針。
[0007] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種精確定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25 的試劑盒。
[0008] 本發(fā)明要解決的第Ξ個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種精確定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25 的檢測(cè)方法。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一組用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的引物和探針，是由用于擴(kuò)增外 源基因pat-T35S的引物和探針，W及用于擴(kuò)增內(nèi)源基因zein的引物和探針組成，序列見(jiàn)表 1。其中，擴(kuò)增外源基因pat-T35S的探針5'端標(biāo)記肥X，3'端標(biāo)記B冊(cè)，擴(kuò)增內(nèi)源基因zein 的探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記B冊(cè)。
[00川表1ddPCR引物/探針序列
[0012]
[0013] 本發(fā)明還提供一種精確定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的試劑盒，該試劑盒包括上 述用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的引物和探針。進(jìn)一步地，該試劑盒還包括完成雙重?cái)?shù)字 PCR反應(yīng)所需材料和試劑，例如陽(yáng)性對(duì)照、ddPCRmastermix、醋酸儀、微滴生成油、微滴生 成卡、96孔板和侶錐熱封膜等，上述材料和試劑優(yōu)選為單獨(dú)包裝。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種精確定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的檢測(cè)方法，特別是一種 利用雙重?cái)?shù)字PCR技術(shù)精確定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的方法，該方法包括：
[0015] (1)提取待測(cè)樣品DNA，可W使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的提取方法或商業(yè)化試劑盒進(jìn) 行提??；
[0016] (2)配制雙重ddPCR反應(yīng)體系，其中，所述反應(yīng)體系包括序列表中SEQIDNO:1至 SEQIDN0:3所示的用于擴(kuò)增外源基因pat-T35S的引物和探針，化及序列表中SEQIDNO: 4至SEQIDNO:6所示的用于擴(kuò)增內(nèi)源基因zein的引物和探針；優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個(gè) 具體實(shí)施方案中，雙重ddPCR反應(yīng)體系如表2所示；
[0017] 表2玉米轉(zhuǎn)基因品系T25雙重ddPCR反應(yīng)體系
[0018]
[0019] ?將步驟似配制的雙重(1(1。0?反運(yùn)體系和微滴生1^油加入微滴生]^^卡中，置于 微滴生成儀中生成微滴；
[0020] (4)將生成的油包水的微滴轉(zhuǎn)移至96孔板中，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件見(jiàn)表3 ;
[0021] 表3玉米轉(zhuǎn)基因品系T25ddPCR反應(yīng)條件
[0022]
[0023] 注：升降溫速度應(yīng)《2. 5°C/s
[0024] 妨結(jié)果判定。
[0025] 將擴(kuò)增后的96孔板置于微滴讀取儀（QX100,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用 如antaSoft軟件進(jìn)行結(jié)果讀取和分析。微滴讀取儀中兩個(gè)信號(hào)通道分別讀取內(nèi)源基因 zein的FAM和外源基因pat-T35S的肥X巧光信號(hào)，含有擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性微滴與不含擴(kuò)增產(chǎn) 物的陰性微滴會(huì)呈現(xiàn)出巧光信號(hào)強(qiáng)度的差異，可W陰性微滴簇巧光幅度的最高點(diǎn)為界來(lái)設(shè) 定闊值線。按照泊松分布原理計(jì)算獲得玉米內(nèi)、外源基因的拷貝數(shù)，進(jìn)而通過(guò)如下公式計(jì)算 獲得轉(zhuǎn)基因玉米T25的百分含量。
[0026]
[0027] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1)對(duì)核酸分子的絕對(duì)定量避免了由PCR擴(kuò)增效率差異所導(dǎo)致的 偏差；2)無(wú)需依賴(lài)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或其他標(biāo)準(zhǔn)品；3)具有更高的精確度、靈敏性和重復(fù)性，易 于標(biāo)準(zhǔn)化；4)更適合低拷貝數(shù)的核酸檢測(cè)，適用于低豐度轉(zhuǎn)基因成分的精準(zhǔn)定量；5)由于 ddPCR是終點(diǎn)檢測(cè)，對(duì)抑制劑的耐受度更高，因此可降低由基質(zhì)類(lèi)型所導(dǎo)致的檢測(cè)偏差。6) 通過(guò)不同的巧光信號(hào)標(biāo)記，更易實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系中內(nèi)外源基因的雙重?cái)U(kuò)增反應(yīng)，從而 降低檢測(cè)成本。
[0028] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開(kāi) 內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1不同退火溫度條件下zein(A)和pat-T35S度）的ddPCR檢測(cè)結(jié)果。
[0030] 圖2雙重ddPCR對(duì)內(nèi)源基因zein(A)和外源基因pat-T35S做的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍。
[0031] 圖3不同濃度A0CS0306-冊(cè)中％T25含量的ddPCR測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1 ddPCR引物、探針設(shè)計(jì)
[0033] 為實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25和玉米基因組的特異性檢測(cè)和絕對(duì)定量分析，我們 分別選取插入pat基因3'端同CaMV35S終止子的連接區(qū)域（Genebankno.DQ156557. 1)W 及玉米單拷貝內(nèi)源基因zein的3'端（GenBankno.JQ083080. 1)作為祀序列，通過(guò)NCBI在 線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì)，利用PrimeExpress軟件￥3.0(481,化31日1·City,CA,USA)設(shè) 計(jì)出50余對(duì)引物和探針組合，經(jīng)過(guò)篩選最終獲得特異性強(qiáng)、適用于ddPCR擴(kuò)增條件的內(nèi)外 源引物/探針組合各1套，序列見(jiàn)表1。外源基因pat-T35S探針5'端標(biāo)記肥X，內(nèi)源基因 zein探針5'端標(biāo)記FAM，兩個(gè)探針的3'端均標(biāo)記B冊(cè)，從而可在同一ddPCR反應(yīng)體系中完 成對(duì)內(nèi)外源基因的同步擴(kuò)增檢測(cè)，為玉米基因組中轉(zhuǎn)基因玉米品系T25含量的相對(duì)定量分 析奠定基礎(chǔ)。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0034] 實(shí)施例2試劑盒組成
[0035] 該試劑盒包括實(shí)施例1設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的引物和探針，陽(yáng)性 對(duì)照（T25轉(zhuǎn)基因玉米葉片基因組DNA，為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)自美國(guó)油類(lèi)化學(xué)家學(xué)會(huì)），ddPCR mastermix(購(gòu)自美國(guó)BioRad公司）、微滴生成油（購(gòu)自美國(guó)BioRad公司）、25mM醋酸儀 (購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）、微滴生成卡（購(gòu)自美國(guó)BioRad公司）、TwinTecSemi-Skirted 96孔板（購(gòu)自德國(guó)化pendo計(jì)公司）、侶錐熱封膜（購(gòu)自美國(guó)BioRad公司）。
[0036] 實(shí)施例3檢測(cè)方法的建立
[0037] 1.DNA提取
[003引采用改良的CTAB法提取樣品中的DNA。具體步驟如下：取lOOmg樣品，加入 300μL滅菌去離子水，充分均質(zhì)混勻；加入700μL預(yù)熱到65°C的CTAB緩沖液，混勻后加 入10μLRNase溶液，振蕩；65°C加熱30min;熱入10μL蛋白酶K溶液，輕輕混勻，65°C加 熱30min;12000g離屯、lOmin，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有500μΙ氯仿的1.5血離屯、管中，振蕩 80s;12000g離屯、15min，直至出現(xiàn)明顯的分層；將上層液相轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有500μL氯仿的 1. 5mL離屯、管中，振蕩；12000g離屯、5min，將上層液相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5mL離屯、管中；加 入2倍體積的CTAB沉淀緩沖液，吹打混勻；室溫下放置60min;12000g離屯、5min，棄去上清； 加入350μL氯化鋼（1. 2M)溶解沉淀；加入350μL氯仿后振蕩30s;12000g離屯、lOmin， 將上層液相轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離屯、管中；加入0. 6倍體積的異丙醇，顛倒混勻后，室溫放置 20min;12000g離屯、lOmin，棄去上清；加入70%乙醇500μL，混勻；12000g離屯、10min，棄去 上清；干燥沉淀后，用100μL滅菌TE重溶DNA。對(duì)提取的核酸用核酸蛋白分析儀（Beckman Coulter,DU800)進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，確保提取核酸的A260/A280在1. 8-2. 0之間，濃度 應(yīng)> 10化g/μL于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0039] 2.按照表2配制20μL的ddPCR反應(yīng)體系
[0040] 3.微滴生成
[0041] 將20μL的ddPCR反應(yīng)體系和70μL微滴生成油分別加入到8孔微滴生成卡中， 置于微滴生成儀（QX100,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中生成微滴。
[004引 4.擴(kuò)增反應(yīng)
[0043] 將生成的油包水的微滴（40μL)緩慢轉(zhuǎn)移至lippendorfTwinTecSemi-Ski;rted 96孔板中，封膜后置于PCR儀（GeneAmp9700,Applied8;[0573161113,化3161·City,CA)上進(jìn) 行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件如表3所示。
[0044] 5.結(jié)果判定
[0045] 將擴(kuò)增后的96孔板置于微滴讀取儀（QX100,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用 如a