雙孢蘑菇ssr分子標(biāo)記特異引物體系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及雙抱磨茹SSR分子標(biāo)記特異引物體系 及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[000引雙抱磨茹（心sriciwAi巧wrus)的人工栽培迄今已有300多年的歷史，是當(dāng)今世 界上第一大宗食用菌。因其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛(ài)，在世界各地廣為栽培， 尤其是近幾年來(lái)，雙抱磨茹的商業(yè)化、規(guī)?；耘嗄Ｊ桨l(fā)展更是迅速。雙抱磨茹在我國(guó)福 建等省已有大規(guī)模的規(guī)范化栽培，國(guó)內(nèi)出口量已占世界第一位。
[0003] 隨著人們對(duì)食用菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的提高，食用菌的遺傳研究已成為關(guān) 注的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，分子生物學(xué)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，遺傳標(biāo)記技術(shù)也得到了迅猛的 發(fā)展。而食用菌最早是采用形態(tài)學(xué)特征為分類依據(jù)，雖然形態(tài)特征能在一定程度上進(jìn)行很 好的類群的劃分，但子實(shí)體的形態(tài)特征易受外界環(huán)境條件的影響，因而很不穩(wěn)定。形態(tài)鑒別 不能準(zhǔn)確反映被鑒定物種的分類地位，還需要輔助其他試驗(yàn)才能將菌株鑒別清楚。同時(shí)，食 用菌中同物異名的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，嚴(yán)重的影響雙抱磨茹的生產(chǎn)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，極大地 損害了育種者和生產(chǎn)者的利益。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)雙抱磨茹的菌種進(jìn)行分子水平 的鑒定，結(jié)合農(nóng)藝性狀進(jìn)行綜合分析，對(duì)雙抱磨茹的菌種利用和保護(hù)，W及功能基因的開(kāi)發(fā) 具有重要的意義。目前，國(guó)外針對(duì)雙抱磨茹的SSR分子標(biāo)記只有33對(duì)，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有針對(duì)雙 抱磨茹遺傳多樣性和菌種鑒定的專用SSR分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決雙抱磨茹同物異名、異物同名的問(wèn)題，而提供一種雙抱 磨茹SSR分子標(biāo)記特異引物體系及其應(yīng)用。
[000引雙抱磨茹SSR分子標(biāo)記特異引物體系，序列如下所示：
[0006] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種雙抱磨茹SSR分子標(biāo)記特異引物體系在菌種鑒 定方面的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了 8個(gè)新SSR分子標(biāo)記和2個(gè)已有SSR分子標(biāo)記的有效組合，并將它 們應(yīng)用于菌種鑒定。W22個(gè)特異菌株的DNA為模板，分別利用10對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，每對(duì)引物擴(kuò)增后進(jìn)行丙締酷胺凝膠電泳，根據(jù)22個(gè)樣品擴(kuò)增出的所有電泳條帶進(jìn)行帶 型統(tǒng)計(jì)分析，從而確定每對(duì)引物的標(biāo)準(zhǔn)帶型。然后將每個(gè)樣品的10對(duì)引物的標(biāo)準(zhǔn)帶型進(jìn)行 組合，構(gòu)建雙抱磨茹22個(gè)不同菌株的分子身份證。本發(fā)明對(duì)于雙抱磨茹的資源鑒定、保護(hù) 和開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0008]圖 1AbSSR0：M和AbSSR035 產(chǎn)生的帶型（AbSSR0：M泳道為菌株CCMJA3 ;AbSSR035 泳道為菌株CCMJA3); 圖 2AbSSR005 產(chǎn)生的帶型(泳道依次為菌株CCMJA7、CCMJA6、CCMJA41、CCMJA27、CCMJA43、CCMJA44、CCMJA47、CCMJA54、CCMJA57、CCMJA58); 圖 3AbSSR013 產(chǎn)生的帶型(泳道依次為菌株CCMJA17、CCMJA3、CCMJA14、CCMJA56、CCMJA21、CCMJA44、CCMJA39、CCMJA47、CCMJA58); 圖 4AbSSR015 產(chǎn)生的帶型（泳道依次為菌株CCMJA4、CCMJA2、CCMJA15、CCMJA51、CCMJA44、CCMJA9、CCMJA47、CCMJA57); 圖 5AbSSROie產(chǎn)生的帶型(泳道依次為菌株CCMJA5、CCMJA48、CCMJA13、CCMJA29、CCMJA33、CCMJA43、CCMJA47、CCMJA57、CCMJA58、CCMJA59); 圖 6AbSSRO18 產(chǎn)生的帶型(泳道依次為菌株CCMJA7、CCMJA3、CCMJA47、CCMJA29、CCMJA54、CCMJA58); 圖 7AbSSR084 產(chǎn)生的帶型（泳道依次為菌株CCMJA3、CCMJA22、CCMJA29、CCMJA57、CCMJA58)； 圖8AbSSR6產(chǎn)生的帶型（泳道依次為菌株CCMJA3、CCMJA7、CCMJA54、CCMJA29、CCMJA44、CCMJA47); 圖9AbSSR36產(chǎn)生的帶型（泳道依次為菌株CCMJA7、CCMJA18、CCMJA3、CCMJA32、CCMJA27、CCMJA47、CCMJA57)。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 實(shí)施例1雙抱磨茹EST-SSR標(biāo)記引物的開(kāi)發(fā) 一、SSR引物設(shè)計(jì)和合成： 從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)中雙抱磨茹H97基因組數(shù)據(jù)（version2. 0)化ttp://genome.jgi-psf.org/.)捜索并下載，利用MISA(ht1:p://pgrc.ipk-gatersleben.de/tools.php)捜索SSR, 捜索標(biāo)準(zhǔn)為：二、Ξ、四、五、六核巧酸的最少重復(fù)次數(shù)大于等于5次。
[0010] 利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer3. 0在含有SSR位點(diǎn)的序列中設(shè)計(jì)引物。SSR引物設(shè)定 參數(shù)為：（1)GC含量為45%-60% ; (2)退火溫度為60°C; (3)預(yù)期片段長(zhǎng)度在150-300bp之 間；（4)引物長(zhǎng)度在18-27bp之間。
[0011] 二、SSR引物的篩選 (1)利用康為世紀(jì)的基因組提取試劑盒提取待鑒定樣品總DNA; 似利用隨機(jī)的10個(gè)雙抱磨茹菌株對(duì)設(shè)計(jì)的SSR分子標(biāo)記引物進(jìn)行初篩步驟（1) 提取的總DM為模板，利用上述設(shè)計(jì)的100對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)用BioRadPCR儀。PCR擴(kuò)增條件如下：95°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s， 共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。PCR采用20μL反應(yīng)體系：DM20 -50ng，10X緩沖液 2.OuL，2. 5ml的dNTPs2. 0uL，Taq酶 0. 25μL，濃度為 10uM的上游引物溶液 0. 3μL，濃 度為10uM的下游引物0. 3μL，添加d地20至體系體積為20uL; (3) 將步驟（2)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙締酷胺凝膠，電泳后利用硝酸銀進(jìn)行銀染 顯影。具體步驟如下：將步驟（2)中PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻后，取0. 5μL點(diǎn) 樣，進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為1XΤΒΕ(TriS-棚酸），在25°C、240V恒壓下電泳1-1.化。 電泳完畢后，用d地20先清洗膠板兩次，然后用硝酸銀溶液緩慢搖動(dòng)并固定5-8分鐘，然后 用d地2〇漂洗2次；將漂洗后的膠板用含有1. 5%氨氧化鋼和0. 5%甲醒的溶液染色5-8分 鐘；緩慢搖動(dòng)，直到條帶清晰，然后用d地2〇漂洗，驚干，照相記錄。上述電泳在核酸電泳系 統(tǒng)度io-Rad，USA)中進(jìn)行； (4) 然后觀察記錄成像結(jié)果，選取條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的SSR引物進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩 利用全世界收集到的59個(gè)雙抱磨茹菌株(表3)為基本群體，選取10對(duì)SSR分子標(biāo)記引物 鑒定收集到的59個(gè)菌株中有多少個(gè)菌株是不同的，按照初篩的PCR條件和體系進(jìn)行PCR和 電泳實(shí)驗(yàn)，根據(jù)電泳條帶的觀察記錄成像結(jié)果，判定菌株的異同。最終從53個(gè)SSR分子標(biāo) 記巧1)選取10對(duì)引物巧2)進(jìn)行菌種身份證的構(gòu)建。
[0012] 表1有多態(tài)性的53個(gè)SSR分子標(biāo)記


表2 10個(gè)SSR分子標(biāo)記特征
表3雙抱磨茹菌種信息

實(shí)施例2雙抱磨茹SSR標(biāo)記引物在品種鑒定中的應(yīng)用 選出多態(tài)性的和特異性好的10對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)上述篩選出的不同的菌株進(jìn)行電子 分子身份證的構(gòu)建。具體步驟如下： 1)每個(gè)引物59個(gè)菌株的PCR產(chǎn)物同樣進(jìn)行步驟（3)中的8%聚丙締酷胺凝膠電泳，然 后統(tǒng)計(jì)不同電泳帶型，確定59個(gè)菌株是否為同一個(gè)菌株。結(jié)果表明59個(gè)菌株中有22個(gè)特 異菌株，其余分不開(kāi)的37個(gè)菌株分成7類： 第一類：與CCMJA29相同的菌株為CCMJA9、CCMJA21 ; 第二類：與CCMJA33相同的菌