C解 育15分鐘。
[0039] C.向該細胞裂解物中加入SyLRNA酶溶液，顛倒離屯、管2-5次混勻，37°C解育15 分鐘，室溫冷卻5分鐘后再進行下一步操作。
[0040]d.加入200μL蛋白沉淀液，并使用滿旋振蕩器高速劇烈振蕩20秒鐘。
[0041]e. 13,ΟΟΟχg離屯、3分鐘，移取上清（含DNA)至一裝有600μL異丙醇的1. 5血小 離屯、管中，棄蛋白沉淀。
[0042]f.輕輕顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成塊狀沉淀。
[0043] g.13,OOOxg室溫離屯、1分鐘，棄去上清，加入70 %乙醇600μL輕輕顛倒離屯、管 數(shù)次，清洗DNA沉淀，13,ΟΟΟχg室溫離屯、1分鐘，使用移液器槍頭吸走乙醇溶液。
[0044] h..將離屯、管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥15分鐘。
[0045]i.向離屯、管中加入 100μLDNARehy化ationSolution，65°C解育 1 小時溶解DNA。 期間可輕彈管壁混勻溶液。也可4°C解育過夜。
[004引j.2-8°C保存DNA備用。
[0047] 2.引物設(shè)計與PCR擴增
[004引（1)引物設(shè)計與合成
[0049] 根據(jù)玉米基因組序列信息獲得玉米薦糖轉(zhuǎn)運蛋白基因ZmSUT4轉(zhuǎn)錄起始位點上游 2500bp左右的序列信息，利用Genomatix軟件進行核屯、啟動子的預(yù)測，根據(jù)預(yù)測啟動子序 列設(shè)計擴增引物，序列如下：
[0050]ZmS4pFw:5'TGGGCAGGGGCTCACCGGGGTAGGG3'；
[0051]ZmS4pRev:5'TTCCGGAGGGGCACCTTCCGCGGCG3' 〇
[0052]引物購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。
[0053] (2) PCR擴增
[0054] W玉米B73基因組DNA為模板，在高保真的LA化q酶（購自TAKARA)的作用下，利 用引物ZmS4pFw和ZmS4pRev進行PCR擴增。
[00巧]反應(yīng)體系為50 μL由下列成分組成：TaKaRaLATaq(5U/ μL)0. 5 μL 10禮ATaq緩 沖液II(Mg2+plus)5μL，預(yù)混dNTP(2.5mMeach)8μL，模版DNA5μL(200ng)，ZmS4pFw 0.4μL ZmS4pRev 0.4μL用滅菌蒸饋水稀釋至50 μL。
[0056]擴增條件為：98°C預(yù)變性 5min;接著98°C，15s，53°C，30s，72°C，Imin進行 35 個循 環(huán)；最后72°C繼續(xù)延伸lOmin。1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，擴增結(jié)果見圖1，目的 片段在1. 0化左右。
[0057] 做擴增片段膠回收、連接、測序及分析
[0058] 將得到的PCR產(chǎn)物克隆到地ACKZero-T載體中，白色克隆經(jīng)PCR檢測插入片段大 小符合預(yù)期長度，進行測序分析。測序結(jié)果表明上述PCR擴增得到的核巧酸序列共96化P， 位于玉米3號染色體的薦糖轉(zhuǎn)運蛋白基因ZmSUT4的上游，將該序列表中的SEQ ID No. 1所 示核巧酸序列的核酸序列命名為ZmSUT4pro啟動子狂mSUT4pro)。
[0059] 也可通過人工合成來制備具有序列表中SEQIDNo.1所示核巧酸序列的核酸片 段。
[0060]利用PlantCARE軟件化t1:p://bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/ plantcare/html)在線分析對所克隆的啟動子片段進行順式元件分析。分析結(jié)果見下表：
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] 結(jié)果表明該啟動子除含有啟動子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件TATA-Box和CAAT-Box外，同時 還含有大量與激素應(yīng)答相關(guān)、脅迫應(yīng)答相關(guān)（生物脅迫與非生物脅迫）、光響應(yīng)相關(guān)、發(fā)育 相關(guān)和組織特異性相關(guān)的順式作用元件，暗示該啟動子在激素、脅迫等條件下可W調(diào)控基 因。
[0065] 實施例2植物表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
[0066] 1.重組表達載體pCAM-ZmSUT4p-GUS的構(gòu)建
[0067] 利用PCR擴增方法將ZmSUT4pro的兩端分別填加HindllI和BamHI酶切位點，所 用引物序列如下：
[0068]ZmSUT4pH-FW:
[0069] 5'CCCAAGCTTGGGCTCACCGGGGTAGGGCTTCTT3'；
[0070]ZmSUT4pB-Rev:
[0071] 5'CGGGATCCCGGGCGCCTAGCACATCATCGA3' 。
[007引弓I物購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司
[0073]W重組的含有ZmSUT4pro的質(zhì)粒DNA為模板，在高保真的LATaq酶的作用下進行 PCR擴增，擴增引物為ZmSUT4pH-FW和ZmSUT4pB-Rev，PCR反應(yīng)體系與擴增條件同實施例 1，擴增產(chǎn)物與地ACKZER0-T載體（購自TaKARA公司）連接，所得白色克隆經(jīng)PCR檢測，選 擇陽性克隆進行測序分析，提取所克隆ZmSUT4啟動子序列正確的質(zhì)粒DNA。使用化ndIII 和BamHI限制性內(nèi)切酶同時酶切重組質(zhì)粒，1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收ZmSUT4啟動子片段。 同樣用化ndIII和BamHI限制性內(nèi)切酶同時酶切pCAM-UGN(申請人自主構(gòu)建的植物表 達載體，骨架是商用的PCAMBIA3300,含有玉米的化iquitin啟動子，驅(qū)動GUS報告基因表 達）質(zhì)粒載體，并回收載體片段。將ZmSUT4啟動子片段與pCAM-UGN載體片段進行連接，重 組質(zhì)粒命名為pCAM-ZmSUT4p-GUS，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖2,將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌種中。
[0074] 2.轉(zhuǎn)ZmSUT4啟動子煙草植株的獲得
[00巧]本生煙草種子若干放在1. 5毫升離屯、管中，加入1ml95 %乙醇滅菌處理6min，將 乙醇吸出用無菌水清洗6次，然后均勻撒在煙草種子培養(yǎng)基MS0上，4°C放置2天后，轉(zhuǎn)入正 常生長條件26°C，晝夜16h/化生長7天，長至有兩片真葉的植株即可侵染。
[0076]將含有pCAM-ZmSUT4p-GUS載體的農(nóng)桿菌EHA105菌液劃線于YEP固體培養(yǎng)基（利 福平25μg/ml，卡那霉素100μg/ml)，28°C暗培養(yǎng)2d，取單菌落劃線于YEP固體培養(yǎng)基（利 福平25μg/ml，卡那霉素100μg/ml)，20°C暗培養(yǎng)3d，直至菌斑長出。一般情況下，一板劃 五條線。刮兩到；條菌重懸于20ml侵染培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有100μΜ乙酷下香酬，將20ml 侵染培養(yǎng)基等分成二份分別放入容積量為100ml的Ξ角瓶中，調(diào)節(jié)OD值至0. 3-0. 4,23度 100巧m振蕩培養(yǎng)2-4h后開始侵染。
[0077] 在鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿上將剛萌發(fā)的小植株切成左右的小段，葉片一 定要切出傷口。將外植體放到空皿上加菌液10ml，侵染lOmin(每隔2分鐘混勻1次）。將 菌液倒掉取出外植體放在無菌濾紙上吸干，將外植體均勻鋪在含濾紙的共培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 室暗培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基進行篩選，2-3周后繼代培養(yǎng)直至抗性小苗產(chǎn)生，將抗性小 苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，待植株長出根系可W將其移栽到花盆中到3-5片真葉時進行PCR檢 測。
[0078] 3.轉(zhuǎn)ZmSUT4啟動子玉米植株的獲得
[0079] 采用芽尖轉(zhuǎn)化法，用于ZmSUT4p功能快速驗證，具體操作步驟：
[0080] 吉853自交系種子經(jīng)70%酒精lOmin，0. 1%化ClzGmin表面消毒，無菌水洗4-5 遍。無菌水浸泡化后，0. 1%化ClzlOmin，徹底洗凈后轉(zhuǎn)到鋪有兩層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中黑 暗條件下萌發(fā)，溫度26°C。約Ξ天后將萌發(fā)種子轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上（M巧，在黑暗下繼續(xù) 生長，至胚芽銷長至5-6畑1。
[0081] 在潔凈工作臺上切除無菌黃化苗多余胚根和側(cè)根，剝?nèi)S化苗芽銷及幼葉，裸露 莖尖生長點用于農(nóng)桿菌感染。
[008引將帶有pCAM-ZmSUT4p-GUS雙元載體（Mini-Ti質(zhì)粒帶有Basta抗性基因bar)的根 瘤農(nóng)桿菌EHA105在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28°C下震蕩