胞克隆。不含MR的祀GFP載體作為試驗對照。
[0058] 綠色巧光蛋白的流式細胞儀分析：對每個載體所得到的穩(wěn)定細胞系，隨機各挑選 5個克隆，用FACS化libur流式細胞儀度ectonDickinson公司）對細胞進行FACS分析。 細胞經上下吹打，制成單細胞懸液，吸取0. 2ml移入FACS管內，經流式細胞儀分析綠色巧 光蛋白的巧光強度。流式細胞儀的數據分析采用Flow化軟件分析，同時用MFI(Meanof fluorescenceindex)來量化巧光強度。結果表明，在五種MAR的DNA元件中，PEGFP-MAR2 轉染的細胞，大約有56. 9%的GFP+陽性細胞，其MFI的數值最高，為1202 ;而祀GFP-MAR5 和祀GFP-MAR3的MFI數值遠低于MR2,甚至MR5大約是MR2的一半，表明MR2具有較 強的增強蛋白表達的能力。W祀GFP的MFI值為基準，從而計算出相對巧光強度的變化。 (見圖5,用圖示的質粒轉染CH0細胞并篩選穩(wěn)定表達的細胞系。每種穩(wěn)定細胞株隨機挑選 5個細胞克隆，進行流式細胞儀分析GFP巧光表達的強度。巧光強度用Flow化軟件進行分 析。W祀GFP作為巧光強度的基準來計算巧光強度的相對值）。
[0059] 綠色巧光蛋白的巧光顯微鏡觀察：用Olympus產FluoviewlOO激光共聚焦巧光顯 微鏡鏡下觀察綠色巧光蛋白在細胞內的表達。結果表明，祀GFP-MAR2載體轉染的細胞，具 有最高的綠色巧光強度（見圖6)可見祀GFP-MAR2載體轉染得到的穩(wěn)定細胞株，相比與不 含MR元件的對照細胞株，有較高的巧光強度），與流式細胞分析結果相一致。運些結果表 明，我們所鑒定的MR2DNA調節(jié)元件具有或增強基因轉錄，從而加強蛋白表達的功能。
[0060] 實施例3:利用分泌型的巧光素酶蛋白在C冊細胞內的穩(wěn)定表達來檢測MR元件 對分泌性蛋白表達的作用
[0061] 構建MAR-pMetLuc表達載體：pMetLuc載體系Clontech公司產品。此載體含 有CMV啟動子，表達分泌型的巧光素酶基因。采用與上述相似的分子克隆方法，把上述中 獲得的MR元件分別插入到pMetLuc載體中CMV啟動子的上游。命名為MR2-pMetLuc， MAR4-pMetLuc，MAR5-pMetLuc。載體的結構示意圖如圖7(pMetLuc載體表達可分泌的巧光 素酶蛋白（圖左）。Ξ個MRDNA調節(jié)元件分別克隆到CMV啟動子的上游（圖右）。pMetLuc 載體用seal酶切?？寺〔捎玫囊锶缦隆?br>[0062]MAR2-山c-F:GGTmTTGTGTGMTOGATAGTACTMGMGCTAGTCAOCMMCMTTMTSEQ。NO. 20
[0063]MAR2-山c-R:AUCTAGGaTAGGATMGTn7VrTGTGMGGTTTTATGGAGACTTCTCSEQ。NO.U
[0064]MAR4-山c-F:GGTmTTGTGTGMTOGATAGTACTMGCMACMGGCAGGATGTAGTTGGSEQ。NO. 22
[00巧]MAR4-山c-R:ATTCTAGGaTAGGATMGTn7VrTGTACCATMCMATCAGGAC0GTCTATGSEQ。NO. 23
[0066]MAR5-山c-F:GGTmTTGTGTGMTOGATAGTACTMCTTCATGMGUMCMQXTGTCSEQ。NO. 24
[0067]MAR5-山c-R:ATTCTAGGaTAGGATMGTn7VrTGTCTGGMATGGAGATMAGATGGTATCSEQ。NO. 25 [006引穩(wěn)定細胞系的篩選及巧光素酶活性的測定：上述構建的攜帶MAR的載體W及作為 對照的pMetLuc用Lipofectmine2000轉染進CH0細胞，按照實施例2相同步驟篩選建立 含有各DNA元件的穩(wěn)定細胞系，再隨機挑選穩(wěn)定克隆進行培養(yǎng)。分泌表達到細胞上清中的 巧光素酶，可作用于其巧光素底物并發(fā)光，根據信號的強弱，可知細胞分泌表達巧光素酶蛋 白的多少。分泌表達的巧光素酶的檢測采用Clontech公司的Read}f-T0-GlowSecreted LuciferaseAssay試劑盒進行分析。由于巧光素酶蛋白分泌到細胞上清，不需要裂解細胞， 因此采用不同時間的細胞上清來觀察不同的MR元件對蛋白表達的作用，化及蛋白表達的 強弱及持續(xù)的時間。對含MR2,MR4,MR5或對照的穩(wěn)定C冊細胞系細胞提取20μL細胞 培養(yǎng)上清，加入巧光素酶的底物50μ^用發(fā)光檢測儀（Mo化lusTMLuminometer)測定其相 對光強度單位巧elativeli曲tunit，RLU)。
[0069] 結果表明，攜帶MR2-pMetLuc的細胞分泌表達的巧光素酶，在12-48小時期間，蛋 白的表達不斷加強，而在48-60小時期間，蛋白隨有所降低，但相比較于MR4,MR5和對照， 仍有較高的表達量；而MAR4,MAR5和對照轉染的細胞，和MAR2相比，不僅它們的蛋白表達 產量低，而且蛋白表達持續(xù)的時間亦較短（見圖8，表達載體，包括pMetLuc,MAR2-pMetLuc, MR4-pMetLuc和MR5-pMetLuc，分別轉染到C冊細胞中，篩選出穩(wěn)定細胞系，再挑選含不 同DNA元件的細胞克隆進行培養(yǎng)。在不同的時間內，取細胞培養(yǎng)上清進行巧光素酶蛋白的 濃度分析）。因此，MAR2元件具有顯著的增強蛋白表達的能力。此結果亦和實施例2中綠 色巧光蛋白表達強度的結果相一致。
[0070] 實施例4 :MR2調節(jié)元件增強肥R2抗體藥物的表達
[0071]Trastuzumab是針對肥R2的單克隆抗體。我們構建表達Tras化zumab的表達載 體。為研究MR2元件在醫(yī)用蛋白質藥物表達的作用，我們亦構建了含有MR2的表達載體。 根據肥R2抗體的氨基酸序列，轉變成核巧酸序列并通過基因合成的方法得到cDNA。運些cDNA包含有Kozak共有序列（GCCACC)，后接起始密碼子（ATG)，隨后是白細胞介素-2的信 號膚序列W介導抗體分泌。相應的限制性內切酶的位點度amHI和EcoRI位點），分別位于 cDNA的5 '端和3 '端W用于載體的構建。在基因合成時，重鏈和輕鏈cDNA通過IRES序列 連接起來。W實施例2中的祀GFP-Control作為模板，進一步構建表達抗體的哺乳動物表 達載體。我們運用現代分子克隆技術，將表達抗體的DNA片段，包括重鏈cDNA-IRES-輕鏈 cDNA，插入到祀GFP-Control表達載體中。
[007引PCR產物經純化后，用BamHI和EcoRI進行酶切反應；與此同時，pEGFP-Control載 體亦用BamHI和EcoRI進行酶切。酶切的產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA分離，回收 所需的DNA片段。隨后，進行體外連接反應，將酶切的質粒載體，與插入片段相連接。經4Γ 過夜，連接產物采用化學方法，轉入到E.coli感受態(tài)細胞中，隨后鋪于含有50ug/ml卡那霉 素的瓊脂平板上過夜培養(yǎng)。細菌克隆被挑選并置于含4ml培養(yǎng)液的試管中，經20化pm振蕩 培養(yǎng)過夜，第二天提取質粒，并酶切鑒定。同時質粒被測序。結果表明，抗體表達的DNA片 段正確地連接到表達載體中，我們將之命名為pH2I。所用的引物序列如下：
[0073]肥R2-F:AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTACAGGATGCAACTC沈Q ID NO. 26
[0074]肥32-1?:了6了6(：了664了41'(：了6〔46勉17(：17結〔4(：1'〔6〇：〇：06176勉6(：1'(：1'化560。備.27
[00巧]為了獲得穩(wěn)定的抗體CK)細胞表達株及提高抗體的表達產量，我們采用傳統(tǒng)的DHFR加壓篩選的方法。因此，我們對上述抑21載體進行改造。通過基因克隆手段，用CH0 細胞的DHFR基因置換抑21載體自身的化romycin抗性基因。所得的載體命名為抑2ID。 然后我們把片段MR2克隆到載體抑2ID中，具體來說，我們PCR擴增MR2,然后采用上述載 體的酶切位點化ul，把MR2插入在CMV啟動子的上游。所得的載體命名為pM肥ID(見圖 9,肥R2的抗體基因，包括重鏈，輕鏈和IRES連接子等，克隆到祀GFP-Control載體CMV啟 動子下游。MR2DNA調節(jié)元件克隆到CMV啟動子的上游?？紤]到穩(wěn)定細胞系的篩選，C冊 細胞的DHFR基因克隆到SV40啟動子之后）。
[007引全人源抗肥R2單克隆抗體表達株的篩選：將上述表達載體，包括pM肥ID，和上 述不含MR2DNA元件的對照抑2ID分別轉染到C冊細胞，經過篩選獲得抗體穩(wěn)定表達的 C冊細胞系。具體步驟如下：CH0/DHFR-細胞，在F12/DMEM(含10%胎牛血清、2mM谷氨酷 胺、lOug/ml甘氨酸、1加g/ml次黃嚷嶺加g/m、胸腺喀晚；37°C，5%C02)培養(yǎng)，取對數生 長期細胞，細胞覆蓋得到約50-70 %，采用脂質體法轉染上述細胞。取5yg質粒及20μ1 Lipofectamine2000Reagent,按Lipofectamine2000Reagent試劑盒說明書進行轉染。每 天觀察細胞的形態(tài)。轉染48小時后，用憐酸緩沖液PBS充分洗涂細胞5次，換選擇培養(yǎng)基 (不含甘氨酸、次黃嚷嶺、胸腺喀晚的F12/DMEM培養(yǎng)基，含7%的血清）培養(yǎng)，培育7-10天， 篩選出pM肥ID陽性，和對照抑2ID陽性的細胞克隆。運些陽性克隆被保存于液氮中。
[0077] 全人源抗肥R2單克隆抗體的表達純化：將上述保存的陽性克隆，每組隨機復蘇 各5株，用50ml無血清培養(yǎng)基巧X-CE化302, SIGMA-ALDRICH公司）培養(yǎng)，用巧roteinASe地aroseA Fast Flow親和柱進行抗體的純化。隨后將純化得到的全人源抗肥R2單克隆 抗體用PBS進行透析，最后用紫外吸收法測定抗體的含量。結果表明，轉染pM肥ID(含有 MR2 DNA調節(jié)片段）的細胞克隆，它們的抗體表達產量，明顯高于不含有MR2 DNA調節(jié)片 段的抑2ID質粒轉染的細胞克隆，抗體的產量大約是后者的3. 5倍左右（見圖10,上述的經 過篩選的細胞株，分別隨機挑選5個，放大到50ml的體積內進行小規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后， 培養(yǎng)上清用ProteinA柱純化抗體，并檢測抗體的產量和濃度）。
[0078] 實施例5:利用MAR元件與睡美人（Sle巧ingBeauty)轉座子結合構建高效肥R2 抗體的表達載體
[0079]"睡美人"轉座子載體由于睡美人轉座子載體獨特的優(yōu)點，其在蛋白的表達，穩(wěn)定 細胞克隆的篩選及基因治療等領域的應用已被廣泛報道，如"Restorationofdystrophin expression