一種改造的中國明對蝦抗菌蛋白基因ALFm的重組表達及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程，尤其是設(shè)及一種改造后的中國明對郵抗菌蛋白基因ALFm 的重組表達和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 對郵養(yǎng)殖是海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一，隨著市場對優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品需求量的不斷增 長，郵類養(yǎng)殖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占據(jù)越來越重要的地位。然而，郵類病害的爆發(fā)性流行使對郵養(yǎng) 殖遭受了巨大損失，多種細菌病毒引發(fā)的對郵疾病頻發(fā)困擾著對郵養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前抗 生素、激素類等藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，雖然對病害控制起到一定的作用，但也破壞了水環(huán)境及 動物體內(nèi)的微生態(tài)平衡，使水產(chǎn)動物失去了正常的菌群屏障及生物括抗作用，同時抗生素 的濫用也將導致細菌產(chǎn)生耐藥性，變異出致病性更強、危害性更大的致病微生物。因此開發(fā) 特異的生物制品藥物來替代傳統(tǒng)抗生素的任務十分緊迫。
[0003] 對郵抗菌膚是一類基因編碼的小分子多膚，在先天性免疫中起到了重要作用。它 們，一般帶有正電荷，能夠?qū)δ承┘毦⒄婢筒《镜染哂休^強的殺傷作用。同時，與傳統(tǒng)抗 生素相比，抗菌膚作為多膚抗生素具有無污染，針對性強，不易產(chǎn)生耐藥性等特點，是解決 對郵病害問題的重要突破口。
[0004] 抗脂多糖因子（Anti-1ipopolysaccharidefactor,ALF)作為甲殼動物的一 類抗菌膚，具有廣譜的抗菌活性W及識別結(jié)合脂多糖的能力，作為先天性體液免疫的重 要效應分子，可W直接殺滅病原，在先天性免疫反應中起著至關(guān)重要的作用，也是近年來 抗菌膚類的研究熱點。在前期的研究中，申請人所在項目組分析了 7種中國明對郵不同 功能域（LPSbindingdomain)的抗菌及抗病毒活性，并通過結(jié)構(gòu)改造證實了其關(guān)鍵的 氨基酸位點和結(jié)構(gòu)特征。一種WFCALF2的LI^結(jié)合結(jié)構(gòu)域為原型，經(jīng)過改造后的短膚 CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC表現(xiàn)出了較強的抗菌活性。但是使用化學方法合成小膚的成本 高，產(chǎn)量少。而利用生物工程的手段，通過工程菌株，則能夠分離純化出具有生物活性的，大 量的ALF功能域小膚，成體較低，可W用于大規(guī)模制備。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]目的在于提供一種抗菌蛋白基因的改造方法及其高效重組表達和應用。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] 改造后的抗菌蛋白ALFm基因：具有序列表SEQIDNo. 1中的堿基序列及SEQID No. 2所示的氨基酸序列。
[0008] 所述ALFm基因的重組表達：進行密碼子優(yōu)化并合成ALFm基因，構(gòu)建真核重組表達 載體pPIC9K-ALFm，電轉(zhuǎn)化到酵母菌株，鑒定陽性克隆，并通過甲醇誘導表達，篩選出表達量 較高的菌株，通過Ni2+親和層析柱，純化出具有活性的重組抗菌蛋白，并檢測其活性；具體 為：
[0009] 1.基因的改造和合成
[0010] 用氨基酸序列CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC替換來源于中國明對郵FcALF2基因（基 因注冊號：JX853775)編碼氨基酸序列中的CSFNVTPKFKRWQLYFRGRMWC序列，獲得具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的ALFm蛋白序列，并在3'末端加上組氨酸標簽序列，將其反譯成 核巧酸序列，并根據(jù)酵母表達的密碼子偏好性，進行密碼子優(yōu)化，獲得SEQ ID No. 1所示的 堿基序列（圖1)。
[0011] 2.重組表達載體及宿主菌的選擇
[0012] 確定使用PPIC9K為真核表達載體，使用畢赤酵母GS115為表達宿主菌。
[0013] 3.重組表達載體的構(gòu)建
[0014] 利用內(nèi)切酶將目的基因從PUC57上剪切下來，連入到PPIC9K載體中，構(gòu)建重組表 達載體pPIC9K-ALFm，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊α感受態(tài)細胞中，利用PCR技術(shù)檢測陽性菌 株（圖2)。
[0015] 4.轉(zhuǎn)化與篩選
[0016] 大量提取重組表達載體pPIC9K-ALFm，用SalI內(nèi)切酶單酶切表達載體，并電轉(zhuǎn)化 到酵母菌GS115中，挑選單克隆菌，進行PCR檢測，篩選出陽性工程菌（圖扣。
[0017] 5.甲醇誘導表達小試
[001引挑選陽性克隆，在BMMY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用甲醇進行誘導，使用Dot-Blot(Anti-His抗體）來檢測上清中的蛋白表達，篩選高表達菌株進行擴大培養(yǎng)。
[0019]6.擴大培養(yǎng)及重組蛋白分離純化
[0020] 選擇用Dot-Blot檢測表達量高的菌株，進行擴大培養(yǎng)。用甲醇進行誘導表達，7化 后離屯、收集上清，經(jīng)陽G20000濃縮后，用Ni-IDA-S巧harose化-她親和層析柱進行純化， 收集流出液，并將上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(抑7.4)進行過夜透析，并 用12%SDS-PAGE電泳分析（圖4A)。
[0021] 7. Western-blot和質(zhì)譜檢測
[0022] 將純化后的蛋白質(zhì)進行電泳檢測，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，由于ALFm蛋白含有His標 簽，用HRP標記的抗化S標簽抗體進行Western-blot檢測（圖4B)。同時對純化后的蛋白 進行MLDI-T0F-MS檢測，分析重組蛋白分子量（圖5)。
[0023] 所述的改造后的抗菌膚重組蛋白對革蘭氏陽性菌和陰性菌的生長均具有抑制作 用，同時該重組蛋白與WSSV病毒解育后，能顯著抑制病毒的感染活性。
[0024] 本發(fā)明有如下優(yōu)點：
[00巧]1.本發(fā)明對一種中國明對郵抗菌蛋白基因FCALF2的功能域進行替換改造后，反 譯成核巧酸序列，并進行密碼子優(yōu)化，更有利于目的序列在酵母中進行重組表達。
[00%] 2.利用本發(fā)明中使用的重組表達載體及宿主菌，能夠成功表達出具有抗菌和抗病 毒活性的重組蛋白。
[0027] 3.意義深遠。本發(fā)明可開發(fā)有效的對郵細菌性和病毒性疾病的防治制劑。同時， 為其他具有抗菌活性蛋白的重組表達研究提供了新的思路。
【附圖說明】 陽02引圖1ALFm的序列信息，（A)ALFm的核巧酸和氨基酸序列；度）重組ALFm蛋白的結(jié) 構(gòu)；(C)ALFm序列密碼子偏好性檢測；
[0029] 圖2重組質(zhì)粒PPIC9K-ALFV的PCR檢測；
[0030] 圖 3PCR檢測重組酵母菌GS115-PPIC9K-ALFV;
[0031] 圖4重組表達蛋白ALi^的SDS-PAGE檢測和Western-Blot檢測，
[0032] A，LaneΜ:P;roteinMarker;Lane1 :誘導后 72 小時；Lane2 :流出液；Lane3 :洗 脫液；
[0033] B，western-blot檢測ALFm表達；
[0034] 圖5ALFm純化蛋白的質(zhì)譜鑒定；
[0035] 圖6利用抑菌圈法檢測重組蛋白ALFm的抑菌活性；A大腸桿菌巧溶藻弧菌；C芽 抱桿菌；D藤黃微球菌；
[0036] 圖7重組蛋白A1A抗WSSV活性。
【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。 陽0測實施例
[0039] 改造后的中國明對郵抗菌蛋白基因ALFm,具有如下序列： 柳4〇] (1)SEQIDNo. 1的信息（參見序列表） 陽OW(a)序列特征W42] *長度：327堿基對 陽0創(chuàng) *類型：核酸
[0044] *鏈型：雙鏈 W45] *拓撲結(jié)構(gòu)：線性
[0046] 化）分子類型：cDNA
[0047] (C)假設(shè)杏
[0048] (d)反義杏
[0049] (e)最初來源：中國明對郵（Fenneropenaeuschinensis) 陽化0] 序列描述：SEQIDNo. 1
[0052] CATCATCATCATCATCAT
[0053] (2)沈QIDNo. 2 的信息
[0054] (a)序列特征 陽化5] *長度：109氨基酸殘基
[0056] *類型：氨基酸 陽057] *鏈型：單鏈 陽05引 *拓撲結(jié)構(gòu)：線性
[0059] (b)分子類型謹白
[0060] 序列描述：SEQIDNo. 2
[0061] 孤孤KSGWEALVPAIADKLTGLWESGELELLGHYCKFKVKPK
[0062] FKRWKLKFKGRMWCPGWTTIGGQAETRSRSGVVGRTTQDFV服
[0063] AFRAGLITESEAQAWLNNHHHHHH
[0064] 一種改造的中國明對郵抗菌基因ALFm的體外重組表達、分離純化及生物活性分 析： 陽0化]在中國對郵FcALF2的基礎(chǔ)上進行改造，用CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC替換原有的 功能域序列CSFNVTPKFKRWQLYFRGRMWC，反譯成核巧酸序列，并合成該基因。利用酵母表達系 統(tǒng)，獲得了具有活性的重組抗菌蛋白。具體如下：
[0066] 1)基因合成 陽067] 根據(jù)改造好的序列，合成該基因SEQIDNo. 1，將該序列連接于PUC57載體中。
[0068] 2)重組表達載體的構(gòu)建
[0069] 利用EcoRI和NotI內(nèi)切酶，雙酶切