大麗輪枝菌腺苷酸激酶靶基因片段及其干擾載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及大麗輪枝菌腺巧酸激酶祀基因片段W及該祀基因片段所轉(zhuǎn)錄的RNA， 還設(shè)及含有所述腺巧酸激酶祀基因片段的干擾載體，本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及所述大麗輪枝菌相 關(guān)的腺巧酸激酶祀基因片段或干擾載體在提高植物對(duì)大麗輪枝菌抗病性中的應(yīng)用，屬于大 麗輪枝菌病程關(guān)鍵基因的克隆及應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花黃萎?。╒erticilliumwilt)是一種典型的±傳性維管束系統(tǒng)性病害，主要 影響著中國(guó)棉花的優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)，被稱為"棉花癌癥"（簡(jiǎn)桂良，鄒亞飛，馬存.棉花黃萎病 連年流行的原因及對(duì)策.中國(guó)棉花.2003, 30:13-14.)。在中國(guó)，其病原菌主要為大麗輪枝 菌（Verticilliumd址liae)。它首先是從植物的根部進(jìn)行侵染，再經(jīng)植物的表皮、皮層和 統(tǒng)管束大量繁殖，并進(jìn)行系統(tǒng)性侵染，最終使整個(gè)植株矮小，黃化、萎黨甚至死亡（Wi化elm S.LongevityoftheVerticilliumwiltfungusinthelaboratoryandfield, ^^opathology1955,45:180-181.)。由于其生理小種眾多、變異較快，且致病機(jī)理復(fù)雜， 目前還沒(méi)有十分有效的防治方法。
[0003] 腺巧酸代謝是初生代謝的重要組成部分，腺巧酸類化合物的含量變化被認(rèn)為是影 響細(xì)胞代謝的主要因素之一（AtkinsonD.Theenergychargeoftheadenylatepool asregulatoryparameterYinteractionwithfeedbackmodifiers.Biochemistry 1968, 11:4030-4034.)。腺巧酸激酶（adenylatekinase,AK)是細(xì)胞中一種重要的憐酸轉(zhuǎn) 移酶，廣泛的存在于真核生物與原核生物中，催化AMP+ATP形成2分子ADP的可逆反應(yīng)，為 生物體的生命活動(dòng)提供所需能量（JanssenE,DzejaPP,0e;rlemansF,etal.Adenylate kinaseIgenedeletiondisruptsmuscleenergeticeconomydespitemetabolic rearrangement.EMBOJournal2000,19:6371-6381.)。同時(shí)，它也是一種核巧酸激酶，調(diào)節(jié) 生物體內(nèi)ADP、ATP、AMP或dATP的之間的濃度，其表達(dá)量直接影響腺巧酸在糖類代謝庫(kù)和核 酸代謝庫(kù)中的分配（SchlattnerU,Wa即erE,G;reppinH,etal.Qiloroplastadenylate kin曰sefromtob曰ccopurific曰tion曰ndp曰rti曰1ch曰r曰cteriz曰tion.Phytochemistry 1996, 42:589-594.)。此外，AK通過(guò)局部或暫時(shí)調(diào)節(jié)AMP的水平來(lái)激活腺巧酸活化蛋白激酶(AMPactivatedproteinkinase,AMPK)，使得生物體內(nèi)受AMP影響的酶和代謝感受物能夠 更加敏感和準(zhǔn)確地對(duì)應(yīng)激信號(hào)做出反應(yīng)（SaltonSR.化urotro地ins,growth-factor-regu latedgenesandthecontrolofenergybalance.MountSinaiJournalofMedicine 2003, 70:93-100;YamauchiT,KamonJ,MinokoshiY,etal.Adiponectinstimulates glucoseutilizationandfatty-acidoxidationbyactivatingAMP-activated proteinkinase.化 1:ureMedicine2002, 8:1288-1295)oAK可W促進(jìn)肌原纖維收縮的速率 和振幅。抑制AK的活性，可W減少肌動(dòng)蛋白的收縮和線粒體的呼吸作用，并且使線粒體和 肌原纖維之間能量的流動(dòng)減慢值z(mì)ejaPP,VitkeviciusKT,Re壯ieldMM,etal.Adenylate kin曰se-c曰t曰lyzedphosphotr曰nsferinthemyoc曰rdium:incre曰sedcontributionin heartfailure.CirculationResea;rchl999, 84:1137-1143.)。用鐵酸四了醋處理細(xì)胞 時(shí)，當(dāng)環(huán)境中ATP濃度較低時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)壞死的情況；當(dāng)環(huán)境中ATP濃度較高時(shí)，細(xì)胞 則會(huì)W調(diào)亡的形式死亡，同時(shí)伴隨有大量的AK從線粒體膜間釋放出來(lái)（Stri化H，F(xiàn)ava E,SingleB,et曰1.Tributyltin2induced曰poptosisrequiresglycolytic曰denosine trisphosphateproduction.ChemicalResearchinToxicology1999, 12:874-882.)。位 于局部非折疊區(qū)的從鄉(xiāng)氨酸到甘氨酸的一小段序列對(duì)AK結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到了非常關(guān)鍵的 作用(AndersonJA,Hilser,VJ.FunctionalunfoldinginE.coliadenylatekinase. Bio地ysicalJournal2015,108:30a.)。
[0004] W前對(duì)于腺巧酸激酶基因的研究，主要集中于酶學(xué)方面的基本性質(zhì)（如酶在能量 平衡W及對(duì)外界環(huán)境抗性中的作用等），在真菌中的研究較少，尤其是其與致病性之間的關(guān) 系。因此，W大麗輪枝菌的腺巧酸激酶基因作為祀基因，研究其與病原菌致病力之間的關(guān) 系，篩選得到與抗大麗輪枝菌相關(guān)的腺巧酸激酶祀基因片段，對(duì)于提高植物對(duì)大麗輪枝菌 的抗病性將具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的之一是提供大麗輪枝菌（Verticilliumd址liae)腺巧酸激酶祀基因 片段W及所轉(zhuǎn)錄的RNA;
[0006] 本發(fā)明目的之二是提供含有所述大麗輪枝菌腺巧酸激酶祀基因片段的RNA干擾 載體和宿主細(xì)胞；
[0007] 本發(fā)明目的之Ξ是將所述大麗輪枝菌腺巧酸激酶祀基因片段或其轉(zhuǎn)錄的RNA應(yīng) 用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性或構(gòu)建獲得抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
[000引為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明首先公開(kāi)了大麗輪枝菌（Verticilliumd址liae)腺巧酸激酶祀基因片段， 其核巧酸序列分別為沈QIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或沈QIDNo. 4所示；優(yōu)選 的，所述腺巧酸激酶祀基因片段的核巧酸序列為SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 4所示；最優(yōu)選 的，所述腺巧酸激酶祀基因片段的核巧酸序列為SEQIDNo. 4所示。
[0010]本發(fā)明采用寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)化ost-in化cedgenesilencing)，w高致 病力的大麗輪枝菌株V991為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)大麗輪枝菌AK編碼序列信息（其核巧酸序列 為SEQIDNo.5所示），設(shè)計(jì)4對(duì)引物，克隆獲得針對(duì)祀基因的4個(gè)不同區(qū)段，其核巧酸序 列分別為SEQIDNo. 1-4所示。本發(fā)明進(jìn)一步將克隆獲得的大麗輪枝菌基因的4個(gè)祀標(biāo)片 段分別構(gòu)建至TRV2載體中，成為VIGS系列RNAi載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，用于本氏煙草的注射， 從注射VIGS干擾載體后的第7天進(jìn)行大麗輪枝菌接種。病情指數(shù)分析結(jié)果表明，與空載相 比，注射真菌祀基因片段的本氏煙草，病情指數(shù)均有所下降；其中分別注射VIGS系列載體 VIGS-1 (祀標(biāo)片段的核巧酸序列為SEQIDNo. 1所示）、VIGS-4(祀標(biāo)片段的核巧酸序列為 SEQIDNo. 4所示）的煙草，病情指數(shù)一直保持在較低水平，初步說(shuō)明祀標(biāo)片段的引入與病 原菌的致病性存在一定關(guān)系，它們可W降低植物的病情指數(shù)。
[0011]此外，由沈QIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3 或沈QIDNo. 4 所示的腺巧酸 激酶祀基因片段所轉(zhuǎn)錄的RNA也自然包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 本發(fā)明所述腺巧酸激酶祀基因片段或所述的腺巧酸激酶祀基因片段所轉(zhuǎn)錄的RNA 能夠應(yīng)用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性，包括W下步驟：（1)構(gòu)建含有所述腺巧酸激 酶祀基因片段的RNA干擾表達(dá)載體；（2)將所構(gòu)建的RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物或植物 細(xì)胞中；（3)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有所述腺巧酸激酶祀基因的RNA干擾載體W及含有所述 RNA干擾載體的宿主細(xì)胞。
[0014] 構(gòu)建含有所述腺巧酸激酶祀基因的RNA干擾載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知，優(yōu)選為Gateway技術(shù)，只需BP反應(yīng)和LR反應(yīng)就可W完成RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0015] 優(yōu)選的，一種構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體的方法，包括：通過(guò)BP反應(yīng)，將權(quán)利要 求1所述的腺巧酸激酶祀基因片段連接至PD0NR207中，再通過(guò)LR反應(yīng)，將其構(gòu)建至 PK7GWIWG2 (I)，0中，得到Gateway干擾載體。
[0016] 本發(fā)明所述RNA干擾載體也能夠應(yīng)用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性，包括W 下步驟：（1)將所述RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；(2)篩選獲得對(duì)大麗輪枝 菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0017] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種培育抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品種的方法，包括W下步 驟：（1)構(gòu)建含有所述腺巧酸激酶祀基因片段的RNA干擾表達(dá)載體；(2)將所構(gòu)建的RNA干 擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；（3)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植 物新品種。
[0018] 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化的方案W及將所述核巧酸引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物 或植物細(xì)胞的類型而變化。將所述核巧酸引入植物細(xì)胞的合適方法包括：顯微注射、電穿 孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和直接基因轉(zhuǎn)移等。
[0019] 本發(fā)明所述植物包括：大麗輪枝菌的寄主植物，優(yōu)選為農(nóng)作物，包括：棉花、煙草、 番茄、馬鈴馨、甜瓜、西瓜、黃瓜或花生中的任意一種或多種。
[0020] 本發(fā)明根據(jù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草病情指數(shù)的變化，選擇核巧酸序列分別為SEQID No. 1、SEQIDNo. 4所示的AK兩個(gè)DNA區(qū)段，用于Gateway干擾載體的構(gòu)建。通過(guò)BP反應(yīng)