將pts基因和ispA基因作為基礎(chǔ)基因組合，W此通過對植物來源的 廣蕾香醇合成酶基因進行密碼子優(yōu)化，構(gòu)建適于微生物系統(tǒng)表達的下游產(chǎn)物合成途徑，實 現(xiàn)首次體外合成廣蕾香醇單體。此外，通過強化MEP途徑和引入MVA途徑，可進一步實現(xiàn)廣 蕾香醇的異源高效合成，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0069]pts基因
[0070] 如本文所用，pts基因的全稱為廣蕾香醇合成酶基因（patchoulolsynthase基 因），編碼廣蕾香醇合成酶PTS，其NCBI登錄號為AY508730,序列如SEQIDNO. : 1所示，其 中0RF位于第1-1659位，編碼長度為552個氨基酸的PTS蛋白（SEQIDNO. : 2)。一種特別 優(yōu)化的、適合大腸桿菌表達的pts基因如SEQIDNO. : 3所示。
[0071]ispA基因
[007引如本文所用，ispA基因的全稱為法尼基焦磯酸合成酶基因（farnesyl pyrophosphatesynthase基因），編碼法尼基焦磯酸合成酶FPPS，其NCBI登錄號為U00096， 序列如SEQIDNO. : 4所示，其中0RF位于第1-900位，編碼長度為299個氨基酸的ispA蛋 白（SEQIDNO. : 5)。
[007引MEP途徑的合成酶
[0074] 類異戊二帰類物質(zhì)在生物體的生長發(fā)育過程中起著很重要的作用。在植物中，送 類物質(zhì)的合成是通過兩條途徑來完成的；（1)定位于細胞質(zhì)中的MVA途徑；（2)定位于質(zhì)體 中的MEP途徑。
[00巧]其中，MEP途徑即甲基蘇糖醇磯酸醋途徑，亦稱作Rohmer途徑，主要參與二聰、單 聰、類胡蘿l·素、異戊二帰等的生物合成。
[0076]MEP途徑W丙麗酸和3-磯酸甘油醒為前體，經(jīng)8步反應(yīng)后合成IPP/DMAPP前體。其 中第一步反應(yīng)1-脫氧木麗糖-5-磯酸合成酶（1-deo巧-D-巧luloseS-phosphate，DX巧是 MEP途徑第一步限速步驟。不同于大腸桿菌，阿維鏈霉菌含有豐富的聰類次級代謝，其MEP 途徑含有dxsl，dxs2兩個不同拷貝的dxs基因。
[0077] 此外異戊帰焦磯酸異構(gòu)酶（Isopent^di地OS地ate,IDI)負責DMAPP和IPP的異 構(gòu)化反應(yīng)。idi基因的表達水平也是影響聰類合成的重要限速步驟。
[007引MVA途徑的合成酶
[0079]MVA途徑主要合成的類異戊二帰類物質(zhì)為固醇，倍半聰，泛釀和多 聰?shù)?。MVA途徑的催化己醜-CoA合成IPP/DMAPP，依次涉及己醜己醜-CoA合 成酶（acetoacet^-CoA，AC0T)，經(jīng)3-居基-3-甲基戊二醜-CoA合成酶 (hy化oxymethylgluta巧 1-CoAsynthase,HMG巧的催化形成 3-居基-3-甲基戊二 醜-CoA合成酶（3-hy化oxy-3-methylgluta巧1 coenzyme A, HMGCoA)，再經(jīng)3-居 基-3-甲基戊二醜-CoA合成酶化y化oxymethylgluta巧1-CoAreductase, HMGR)的催 化下生成甲居戊酸（mevalonate, MVA),之后在MVA激酶（mevalonate kinase, MK)的作 用下形成磯酸甲居戊酸（mevalonate-5-phosphate, MVAP)，接著在磯酸甲居戊酸激酶 (地0S地omevalonatekinase, PMK)的作用下生成焦磯酸甲居戊酸（mevalonate-5-di地osp hate, MVAPP)，最終在甲居戊酸焦磯脫駿酶（mevalonatepyrophosphatedecarbo巧lase, MP D)的作用下生成聰類物質(zhì)合成前體異戊帰焦磯酸（Isopenteny，IP巧。大腸桿菌中自身僅 W MEP途徑供應(yīng)聰類前體，僅存在著atoB基因編碼MVA途徑的第一個酶AC0T。不同于大腸 桿菌，糞腸球菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌W MVA途徑作為聰類前體合成途徑?；?于本研究組前期的工作，本發(fā)明人選取了最佳的MVA途徑基因模塊即糞腸球菌中編碼HMGS 的基因mvaS，編碼HMGR的基因mv址，W及金黃色葡萄球菌中編碼MK的基因mvaKl，編碼PMK 基因的mvaK2,編碼MPD基因mvaD，組裝MVA途徑。
[0080] 表達載體、宿主細胞和重組方法
[0081] 本發(fā)明還提供了基于本發(fā)明的上述基礎(chǔ)基因組合和優(yōu)選基因組合的構(gòu)建物、表達 盒和載體等。
[0082] 在本發(fā)明中，一種代表性的基因表達盒從5' -3'依次具有下列組件；本發(fā)明的啟 動子、外源基因0RF序列和終止子。
[0083] 本發(fā)明還提供了一種重組載體，其包含本發(fā)明所述廣蕾香醇基礎(chǔ)基因組合（或優(yōu) 選基因組合）的表達盒。在優(yōu)選的實施方式中，所述重組載體的啟動子下游包含多克隆位 點或至少一個酶切位點。需要表達目的基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶 切位點，從而可操作地連接目的基因與啟動子。
[0084] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述重組載體在5'到3'方向上包括；啟動子，目的基 因和終止子。
[0085] 如果需要，所述重組載體還可W包括W下組件；3'多聚核巧酸化信號；非翻譯核 酸序列；轉(zhuǎn)運和祀向核酸序列；抗性選擇標記（二氨葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性 W及綠色英光蛋白等）；增強子；或操作子。
[0086]用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。表達載體可W是細菌 質(zhì)粒、瞻菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其它載體?？傊灰淠軌?在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可W被采用的。
[0087] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W采用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明所述廣蕾香醇基礎(chǔ)基 因組合（或優(yōu)選基因組合）的表達載體。送些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、 體內(nèi)重組技術(shù)等。
[0088] 本發(fā)明的表達盒或載體，可W用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，W使宿主表達蛋白質(zhì)。
[0089] 此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，W提供用于選擇轉(zhuǎn)化 的宿主細胞的表型性狀，如二氨葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性W及綠色英光蛋白 (GF巧等。包含上述適當?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可W用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎琖使 其能夠表達蛋白質(zhì)。
[0090] 用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。表達載體可W是細菌 質(zhì)粒、瞻菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其它載體?？傊灰淠軌?在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可w被采用的。
[0091] 本發(fā)明的表達盒或載體，可W用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎琖使宿主表達蛋白質(zhì)。宿 主細胞可W是原核細胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；或是低等真核細胞，如酵母細胞； 或是高等真核細胞，如植物細胞。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體和宿主 細胞。
[0092] 特別優(yōu)選的宿主細胞是原核細胞（如大腸桿菌）和低等真核細胞（如酵母）。
[0093] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原 核生物（如大腸桿菌）時，可W用化Cl2法處理，也可用電穿孔法進行。當宿主是真核生物， 可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法；磯酸巧共沉淀法，常規(guī)機械方法（如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體 包裝等）。
[0094] 另一類優(yōu)選的宿主細胞是植物細胞。此外，本發(fā)明還提供了用所述轉(zhuǎn)化的植物細 胞所再生的植物（尤其是除了廣蕾香植物的其它植物，如煙草、水稻、小麥、棉花等）。
[0095] 轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花 芽浸泡法等。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可W用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基 因的植物。
[0096] 所述的多核巧酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會 使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于 啟動子W增強基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強 子和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。
[0097] 本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：
[0098] (1)在原核生物中成功實現(xiàn)廣蕾香醇的高效異源合成。
[0099] (2)本發(fā)明利用微生物實現(xiàn)了廣蕾香醇的合成，該技術(shù)可適用于廣蕾香醇的微生 物大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。
[0100] (3)本發(fā)明提供了可生物合成廣蕾香醇的微生物工程菌株，完成了對廣蕾香醇合 成酶的酶學特性改造，可應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模提高底物特異性等技術(shù)領(lǐng)域。
[010。 （4)本發(fā)明利用了其它微生物來源的MEP途徑基因強化MEP途徑，再此基礎(chǔ)上引入 了不同來源MVA途徑基因裝配的MVA途徑，用于聰類前體的強化，成功地提高了廣蕾香醇的 合成。
[0102] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，送些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。粚嶒炇沂謨裕∟ewYork:ColdSpringHarbor L油oratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0103] 通用方法和材料
[0104] 工程菌株的發(fā)酵
[0105] 將相關(guān)的質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌化21值E3)，挑取單菌落過夜培養(yǎng)12h， 離必收集菌體后，加入等體積15%的甘油作為搖瓶發(fā)酵的種子，-8(TC凍存。按2%的接種 量，將凍存的種子液接種到含10mlTB培養(yǎng)基的100ml搖瓶中，同時20%的十二焼和終濃度 為0.ImM的IPTG，至于28°C，