一種kiaa1217-ret融合基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種KIAA1217-RET融合基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲狀腺癌的發(fā)病率在近30年里已增長了Ξ倍W上，其不同組織類型和基因表達 譜也已隨著時間有所改變。在所有的甲狀腺癌中，除髓樣癌外，都是起源于組成甲狀腺單細 胞上皮層的濾泡細胞。甲狀腺乳頭狀癌（Papillary化yroidCarcinoma,PTC)是甲狀腺惡 性腫瘤中最常見的病理類型，因其有乳頭的組織學(xué)結(jié)構(gòu)而得名，大約占到所有甲狀腺惡性 腫瘤中的80%。PTC往往是可治愈的，其5年生存率約為95%。然而一些PTC會去分化變 為侵襲性、致命性的甲狀腺癌。目前的主要治療方案有外科手術(shù)、甲狀腺抗T甜激素的內(nèi)分 泌治療和放射性艦治療（利用甲狀腺濾泡細胞對艦有高親和力的原理）。
[0003] RET/RAS/BRAF/MAPK信號通路上的基因變化，現(xiàn)已證實在乳頭狀癌的發(fā)病機制上 起著非常關(guān)鍵作用。所有乳頭狀癌中約有70%的基因改變發(fā)生在運條通路上，而且RET/ RAS/BRAF基因變化很少存在交叉重疊，提示該通路中一個效應(yīng)分子的激活即足W產(chǎn)生細 胞的惡性轉(zhuǎn)化。運條通路中最普遍的基因變化是BRAF基因的V600E突變，其發(fā)生率約占 到乳頭狀癌的40%。也有報道稱發(fā)現(xiàn)存在由BRAF染色體重排引起的甲狀腺乳頭狀癌即 AKAP9-BRAF融合。運種重排現(xiàn)象很少出現(xiàn)在散發(fā)性的乳頭狀癌中，而更多見于由福射引起 的甲狀腺惡性腫瘤中。在甲狀腺乳頭狀癌中約有10%存在RAS基因（N-RAS，H-RAS，K-RA巧 的點突變，且大多數(shù)發(fā)生在濾泡亞型的乳頭狀癌中。染色體重排相關(guān)的RET原癌基因激活 是在PTC中另一個比較常見的基因改變。
[0004] RET原癌基因位于10染色體的1區(qū)1帶2亞帶（即lOqll. 2)，其編碼生成跨細 胞膜的酪氨酸激酶受體蛋白。該蛋白由Ξ個結(jié)構(gòu)域組成：配體結(jié)合域（包括四個巧粘蛋白 樣重復(fù)結(jié)構(gòu)和一個富含半脫氨酸結(jié)構(gòu)）、疏水跨膜域和包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)域。其 配體屬于膠質(zhì)細胞源性的嗜中性因子家族，包括有neurtu;rin(NRTN)、perse地in(PSPN)和 artemin(ARTN)，和配體結(jié)合后導(dǎo)致酪氨酸激酶受體的二聚體化，自體憐酸化胞內(nèi)域中關(guān)鍵 部位的酪氨酸激酶，激活相關(guān)下游信號通路。
[0005] 在甲狀腺組織中，RET原癌基因高表達于濾泡旁細胞（即C細胞），其點突變可導(dǎo) 致甲狀腺髓樣癌的發(fā)生發(fā)展。在甲狀腺濾泡細胞中，RET原癌基因可因染色體重排而被激 活，導(dǎo)致一些不相關(guān)基因的5'端和RET基因的3'端發(fā)生融合，產(chǎn)生RET/PTC重排。最早被 鑒定發(fā)現(xiàn)的Ξ種RET/PTC重排也是最為多見的乳頭狀癌重排致癌類型。其中，RET/PTC1和 RET/PTC3分別由H4基因（亦稱D10S170或CCDC6)和NC0A4基因（亦稱RFG或ELE1)與 RET基因發(fā)生融合形成。RET/PTC1和RET/PTC3均由同條染色體的同臂轉(zhuǎn)位形成，即發(fā)生融 合的上下游兩個基因都位于第10號染色體。不同的是，RET/PTC2是第10號和第17號染 色體發(fā)生易位，導(dǎo)致P服ARIA和RET形成融合。近些年來，一系列新類型的RET/PTC融合被 報道發(fā)現(xiàn)于PTC病例中，其中絕大多數(shù)是由染色體間易位而形成。
[0006] 雖然已發(fā)現(xiàn)一些與PTC相關(guān)的基因改變，但仍有一部分的甲狀腺癌發(fā)生機制未 明。因此，還需要進一步對其進行研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，而提供一種新的RET融合 即KIAA1217-RET，該融合基因有助于進一步探究甲狀腺癌中未發(fā)現(xiàn)驅(qū)動基因改變，優(yōu)化甲 狀腺乳頭狀癌患者的臨床病理分類和診治策略。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是該KIAA1217-RET融合基因由KIAA1217基 因的第1-11號外顯子和RET基因的第8-19號外顯子相融合組成，其核巧酸序列如SEQID NO: 1所示。
[0009] 進一步設(shè)置是KIAA1217-RET融合基因所表達的KIAA1217-RET融合蛋白定位于細 胞核中，并降低MAPK通路活性。KIAA1217-RET融合基因所表達的KIAA1217-RET融合蛋白 通過卷曲螺旋結(jié)構(gòu)形成自身二聚體，激活KIAA1217-RET融合蛋白中RET蛋白的激酶域活 性。
[0010] 進一步設(shè)置是一種多膚，其特征在于：其由所述的KIAA1217-RET融合基因編碼獲 得。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0012]KIAA1217-RET編碼蛋白的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其定位于細胞核，并用RET抗體的免疫 巧光實驗驗證其彌散地定位于腫瘤細胞的核膜周圍。用免疫印跡實驗檢測RET蛋白激活 MAPK信號通路的能力。由于彌散地定位于細胞核，導(dǎo)致在胞質(zhì)中RET蛋白激活MAPK信號 通路的能力減弱。融合基因激活酪氨酸激酶通過融合上游基因高活性的啟動子促進嵌合 基因的表達，并利用二聚體功能域介導(dǎo)配體非依賴性的二聚體化和激酶活性的激活。運用 COILS和化ircoil2軟件發(fā)現(xiàn)KIAA1217-RET融合蛋白存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（CC結(jié)構(gòu)），激活 KIAA1217-RET融合蛋白中RET蛋白的激酶域活性。
[0013] 下面結(jié)合說明書附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步介紹。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發(fā)明的KIAA1217-RET融合基因的轉(zhuǎn)錄組測序基因序列融合圖，圖1的中間 豎線為融合基因的連接點位置；
[001引圖2R56T的完整性化IN)鑒定圖；
[0016] 圖3R56N的完整性（RIN)鑒定；
[0017] 圖4R56T的堿基組成情況圖；
[0018] 圖5R56T的堿基質(zhì)量值分布情況圖；
[0019] 圖6R56T的比對統(tǒng)計結(jié)果圖；
[0020] 圖7R56N的比對統(tǒng)計結(jié)果圖；
[0021] 圖8R56T的測序隨機性評估圖；
[002引圖9R56N的測序隨機性評估圖；
[0023] 圖10R56T的基因覆蓋度統(tǒng)計圖；
[0024] 圖11R56N的基因覆蓋度統(tǒng)計圖；
[00巧]圖12 20個病人（包括癌與癌旁組織）轉(zhuǎn)錄組測序的融合基因Circos圖；
[0026] 圖13R56T轉(zhuǎn)錄組測序的融合基因Circos圖（其中KIAA1217-RET融合用紅框標 注）；
[0027] 圖14KIAA1217的基因坐標圖
[0028] 圖15RET的基因坐標圖；
[0029] 圖16KIAA1217-RET融合基因的分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)圖；
[0030] 圖17選擇KIAA1217-RET融合基因最佳引物的預(yù)實驗圖；
[0031] 圖18KIAA1217-RET融合基因的正向Sanger測序圖；
[003引圖19KIAA1217-RET融合基因的反向Sanger測序圖；
[0033]圖 20KIAA1217-RET融合基因的WesternBlot圖；
[0034] 圖21NNCN算法預(yù)測融合蛋白定位的結(jié)果圖；
[0035] 圖22k-NN算法預(yù)測融合蛋白定位的結(jié)果圖；
[0036] 圖23帶綠色巧光標記的KIAA1217-RET融合蛋白定位圖；
[0037] 圖24R56腫瘤和正常標本的MAPK通路水平WesternBlot圖
[0038] 圖25R56標本中切clinD1、MMP1和MMP9的RNA表達水平圖；
[0039] 圖26運用COILS(左）和化ircoil2(右）軟件對新融合蛋白是否存在卷曲螺旋 結(jié)構(gòu)的預(yù)測圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不 能理解為對本發(fā)明保護范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明 作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
[0041] (一）、KIAA1217-RET融合基因的獲得和篩選
[0042]1甲狀腺乳頭狀癌組織標本來源
[0043]1. 1標本入組標準
[0044] 樣品均來自本院腫瘤外科診斷為甲狀腺乳頭狀癌的患者手術(shù)切除標本，且所有20 例患者術(shù)前均未接受過其它醫(yī)學(xué)干預(yù)治療（如放化療）。標本收集之前，已獲醫(yī)院倫理委 員會批準，并在術(shù)前和患者及其家屬簽署知情同意書。腫瘤分期參考美國癌癥聯(lián)合委員會 (AJCC)的甲狀腺乳頭狀癌分類標準。每一個腫瘤組織標本