基于轉(zhuǎn)opn基因誘導(dǎo)的肝細(xì)胞體外增殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及肝細(xì)胞體外增殖技術(shù)，具體涉及一種基于轉(zhuǎn)0ΡΝ基因誘導(dǎo)的肝細(xì)胞體外增殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟作為人體的重要器官，擔(dān)負(fù)著合成和分泌膽汁、代謝、解毒和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種功能。許多理化因素、生物因素等可損傷肝臟，導(dǎo)致肝細(xì)胞再生受阻，肝臟結(jié)構(gòu)受到破壞，產(chǎn)生一系列肝臟疾病。晚期肝臟疾病(肝硬化、肝癌)的5年生存率僅為14%。當(dāng)前治療終末期肝臟疾病主要有肝臟整體移植和干(肝)細(xì)胞移植等途徑，然而，肝移植由于肝源缺乏和免疫排斥、干細(xì)胞移植由于各種研究瓶頸和缺陷而限制其應(yīng)用，但成熟肝細(xì)胞移植卻為等待供肝源的患者提供了過(guò)渡性治療，并開(kāi)始應(yīng)用于肝急性損傷和先天性肝臟疾病。所以，目前對(duì)功能完善的肝細(xì)胞有較高的需求，其中，肝細(xì)胞的數(shù)量及其增殖能力對(duì)其移植后肝臟疾病的恢復(fù)具有重要的意義。體外分離、培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞雖具有較完整的肝細(xì)胞功能，但體外培養(yǎng)中難以增殖和長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞的功能。因此，提高肝細(xì)胞體外增殖能力是解決肝細(xì)胞來(lái)源匱乏的一個(gè)重要方向，目前實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞體外增殖的策略有在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子、激素或化學(xué)物質(zhì)等。
[0003]骨橋蛋白(osteopontin,0ΡΝ)，又稱分泌磷蛋白 1 (secreted phosphoprotein1, SPP1 )，早期 T 細(xì)胞活化因子 1 (early T-cell activat1n factor, Eta_l)等，是一種帶負(fù)電荷的分泌型磷酸化糖蛋白，屬于Thl細(xì)胞因子成員。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn):在病理過(guò)程中，0ΡΝ通過(guò)作用于自然殺傷性T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肝星形細(xì)胞和肝癌細(xì)胞而參與促進(jìn)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞活化、增殖或迀移，從而在肝炎、肝纖維化或肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。其中，日本的一個(gè)課題組通過(guò)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)0ΡΝ在肝再生中參與誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞的活化和增殖。劉瑩瑩等也證實(shí)了 0ΡΝ能夠促進(jìn)卵圓細(xì)胞的增殖。在肝損傷引起的肝纖維化中，0ΡΝ參與促進(jìn)肝星形細(xì)胞的活化和增殖。此外，0ΡΝ能通過(guò)自分泌和旁分泌誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。
[0004]在現(xiàn)有技術(shù)下檢索與本發(fā)明主題相關(guān)的文獻(xiàn)與報(bào)道發(fā)現(xiàn)，俞燕等公開(kāi)了 0ΡΝ對(duì)于化學(xué)性或藥物性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，但Sahai等在非酒精性脂肪肝的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，0ΡΝ促進(jìn)肝細(xì)胞釋放谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)而導(dǎo)致肝臟受損。王曉東等人報(bào)道，重組人0ΡΝ(rhOPN)可顯著抑制小鼠原代肝細(xì)胞的體外增殖，而聞衍凱等人發(fā)現(xiàn)不同濃度的重組大鼠OPN (rmOPN)處理對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。為此，我們通過(guò)腺病毒載體將大鼠0ΡΝ基因?qū)氪笫笤渭?xì)胞中，并達(dá)到了體外促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為克服體外給予重組0ΡΝ對(duì)肝細(xì)胞增殖作用不良的現(xiàn)狀，提供了一種基于轉(zhuǎn)0ΡΝ基因誘導(dǎo)的肝細(xì)胞體外增殖方法，即通過(guò)轉(zhuǎn)0ΡΝ基因從而促進(jìn)肝細(xì)胞的體外增殖，拓展了骨橋蛋白在肝細(xì)胞增殖方面的新用途，進(jìn)而能夠用于肝組織工程中肝細(xì)胞的擴(kuò)增或進(jìn)一步用于體內(nèi)治療，達(dá)到促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的效果。
[0006]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案，基于轉(zhuǎn)0ΡΝ基因誘導(dǎo)的肝細(xì)胞體外增殖方法，其特征在于通過(guò)腺病毒載體將大鼠0ΡΝ基因?qū)氪笫笤渭?xì)胞中誘導(dǎo)其體外增殖，其中大鼠0ΡΝ基因(GeneBank登錄號(hào)AB001382)序列為:
atgagactgg cagtggtttg cttttgcctg ttcggccttg cctcctgtct cccggtgaaa 60gtggctgagt ttggcagctc ggaggagaag gcgcattaca gcaaacactc agatgctgta 120gccacttggc tgaagcctga cccatctcag aagcagaatc ttctagcccc acagaattct 180gtgtcctctg aagaaacgga tgactttaag caagaaactc ttccaagcaa ctccaatgaa 240agccatgacc acatggacga tgatgacgac gacgatgacg atggagacca tgcagagagc 300gaggattctg tgaactcgga tgaatctgac gaatctcacc attccgatga atctgatgag 360tccttcactg ccagcacaca agcagacgtt ttgactccaa tcgcccccac agtcgatgtc 420cctgacggcc gaggtgatag cttggcttat ggactgaggt caaagtccag gagtttccct 480gtttctgatg aacagtatcc cgatgccaca gatgaggacc tcacctcccg catgaagagc 540caggagtccg atgaggctct caaggtcatc ccagttgccc agcgtctgag cgtgccctct 600gatcaggaca gcaacgggaa gaccagccat gagtcaagtc agctggatga accaagcgtg 660gaaacacaca gcctggagca gtccaaggag tataagcaga gggccagcca cgagagcact 720gagcagtcgg atgcgatcga tagtgccgag aagccggatg caatcgatag tgcggagcgg 780tcggatgcta tcgacagtca ggcgagttcc aaagccagcc tggaacatca gagccacgag 840tttcacagcc atgaggacaa gctagtccta gaccctaaga gtaaggaaga tgataggtat 900ctgaaattcc gcatttctca tgaattagag agttcatctt ctgaggtcaa ttaa9540
[0007]本發(fā)明所述的基于轉(zhuǎn)OPN基因誘導(dǎo)的肝細(xì)胞體外增殖方法，其特征在于具體步驟為:(1)大鼠0ΡΝ基因的獲得，通過(guò)PCR方法從大鼠再生肝組織中獲得0ΡΝ基因的開(kāi)放閱讀框(0RF)片段，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切；(2)重組腺病毒載體的構(gòu)建，對(duì)腺病毒載體pHBAd-MCMV-RFP進(jìn)行雙酶切，將酶切好的0ΡΝ基因的0RF片段與酶切載體連接，通過(guò)轉(zhuǎn)化、篩選陽(yáng)性克隆和搖菌后提取含有0ΡΝ基因的重組質(zhì)粒；(3)腺病毒的包裝與擴(kuò)增，采用脂質(zhì)體法將重組0ΡΝ質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后收毒并擴(kuò)增，對(duì)第三代病毒進(jìn)行感染性滴度測(cè)定；(4)大鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，采用兩步灌流法分散肝臟細(xì)胞，用體積濃度為60% Percoll離心法分離、純化肝細(xì)胞，并鋪于膠原蛋白預(yù)處理的培養(yǎng)板上培養(yǎng)；(5)腺病毒對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞的體外侵染，按照M0I=50的比例加入腺病毒顆粒侵染大鼠原代肝細(xì)胞以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的體外增殖。
[0008]本發(fā)明提供的方法成本低廉，操作簡(jiǎn)單，能夠達(dá)到較好的肝細(xì)胞體外增殖效果。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1是過(guò)表達(dá)大鼠0ΡΝ基因?qū)Ω渭?xì)胞活力的影響圖；
圖2是過(guò)表達(dá)大鼠0ΡΝ基因?qū)Ω渭?xì)胞周期分布的影響圖；
圖3是過(guò)表達(dá)大鼠0ΡΝ基因?qū)Ω渭?xì)胞增殖能力的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0011]第一部分腺病毒載體的構(gòu)建
1.0ΡΝ基因0RF片段的PCR擴(kuò)增、回收與酶切
按照Higgins和Anderson創(chuàng)立的方法建立經(jīng)典的大鼠2/3部分肝臟切除模型，并取72h再生肝組織為實(shí)驗(yàn)材料，用Invitrogen公司的Trizol試劑提取72h肝組織的總RNA，采用Promega的AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μ g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以合成的第一鏈cDNA為模板，以 OPN-F: acacgcggccgcATGAGACTGGCAGTGGTTTGC 冷 Not I 酶切位點(diǎn))和 OPN-R:acacatgcatTTAATTGACCTCAGAAG (含Afei I酶切位點(diǎn))為上下游引物，用Τ0Υ0Β0的高保真酶KOD plus在57°C的退火溫度下進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)，以擴(kuò)增0ΡΝ基因的0RF區(qū)。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，后用北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的DNA快速純化/回收試劑盒回收0ΡΝ的0RF片段。隨后對(duì)彡1 μ g的回收產(chǎn)物在37°C下進(jìn)行Not I和NsiI的雙酶切3h，酶切完成后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、膠回收和純化。
[0012]2.pHBAd-MCMV-RFP載體的酶切與回收
將< 1 μ g的pHBAd-MCMV-RFP質(zhì)粒載體在37°C下用Abi I和Nsi I進(jìn)行雙酶切3h，酶切完成后同樣對(duì)酶切體系進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，接著進(jìn)行載體片段的膠回收和純化。
[0013]3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
將酶切均完成的0ΡΝ基因0RF與載體在16°C連接過(guò)夜連接(16-18h)，通過(guò)轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞、平板挑菌和過(guò)夜搖菌，將菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的單克隆送測(cè)序鑒定，將經(jīng)鑒定成功的重組質(zhì)粒簡(jiǎn)化命名為pAd-OPN，同時(shí)也做空載pHBAd-MCMV-RFP對(duì)DH5a的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆篩選，并命名為pAd-RFP，作為陰性對(duì)照載體。
[0014]第二部分0ΡΝ過(guò)表達(dá)腺病毒的生產(chǎn) 1.大量制備重組質(zhì)粒
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的pAd-OPN菌液和pAd-RFP.菌液2mL分別加入100mL含100 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C 300rpm震蕩搖菌過(guò)夜，采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的中提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。
[0015]2.重組腺病毒載體的包裝，收毒及擴(kuò)增
轉(zhuǎn)染前一天，將293細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為含10% (v/v) Hyclon胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37°C含體積濃度為5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞生長(zhǎng)的匯合率為70%-80% (面積比)時(shí)，取腺病毒質(zhì)粒pAd-OPN和pAd-RFP，分別與骨架質(zhì)粒pHBAd_BHG組合，并用Invitrogen的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液。待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒。即將60mm培養(yǎng)皿中所有細(xì)胞及培養(yǎng)液收于15mL離心管中，將15mL離心管在液氮及37°C水浴反復(fù)凍融三次后，3000rpm離心5分鐘，收集含病毒的上清液，棄沉淀。該上清即為0ΡΝ過(guò)表達(dá)腺病毒第一代毒種，將作為隨后大量病毒擴(kuò)增的毒種。從P1代病毒上清(約3mL左右)中取2mL去感染10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞(細(xì)胞匯合率90%以上)。余下的病毒上清放入凍存管中_80°C保留，作為毒種保留。病毒擴(kuò)增兩天后待所有細(xì)胞脫落底面即可進(jìn)行收毒，將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一同收入15mL離心管中，依據(jù)前面的凍融方法，凍融三次，取上清進(jìn)行下一代擴(kuò)增或于-80°C保存。如此操作得到第二代和第三代病毒。
[0016]3.感染性滴度檢測(cè)
采用改進(jìn)的TCID50法對(duì)第三代腺病毒的滴度進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果為1 X 1010PFU/mL,體積lmL，總滴度為:1X101Q PFU。
[0017]第三部分大鼠原代肝細(xì)胞的分離
將質(zhì)量濃度為3%的戊巴比妥鈉溶液按照1.5mL/kg腹腔注射大鼠，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒腹部皮膚，十字打開(kāi)腹腔，暴露肝門(mén)靜脈，插管，結(jié)扎肝上