可W使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清 楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳切開，而且PCR時間較短。但是，如果時間過短，則特異條帶不能 完全擴(kuò)增而使得擴(kuò)增產(chǎn)物較少，電泳后難W區(qū)分判斷；如果時間過長，則增加非特異條帶的 出現(xiàn)幾率，出現(xiàn)雜帶影響觀察效果。
[0024] 在本發(fā)明中，PCR反應(yīng)成分可W包含DNA模板、上下游引物、TaqDNA polymerase(DNA聚合酶或亦可稱作"Taq酶"）、緩沖液、Mg2+等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例 中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可W使用TaqDNApolymerase(DNA聚合酶）及其TaqAntibody。Taq Antibody是TaqDMpolymerase的單克隆抗體，其與TaqDMpolymerase結(jié)合后抑制DM 聚合酶活性，兩者的親和力非常高，即使在65°C下仍然可W封閉化qDMpolymerase的活 性，因此可W非常有效地抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，具 有極高的擴(kuò)增靈敏度和特異性。TaqAntibody只需要在95°C加熱30s即可完全失活，釋放 TaqDNApolymerase活性，保證了后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠順利進(jìn)行。 陽02引 PCR反應(yīng)中可W加入抑值為8. 1~8. 7的Tris-肥L緩沖液，在72°C延伸反應(yīng)時 調(diào)整PCR溶液抑值在6. 8~7. 8之間，從而使Taq酶在偏堿性環(huán)境中更好地發(fā)揮活性。另 夕F，PCR溶液中還可W加入明膠化01%)W減少PCR管對Taq酶的吸附作用，穩(wěn)定酶活性 及保護(hù)作用，促進(jìn)PCR反應(yīng)。
[0026] 另外，PCR溶液中1邑2+濃度在1. 5~2.Ommol/L之間時，可W很好地控制PCR反應(yīng) 的產(chǎn)率和特異性。
[0027] PCR反應(yīng)引物的終濃度一般為0. 1~1 μΜ左右，濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太 低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。
[0028] 此外，PCR反應(yīng)中還可W加入助溶劑二甲亞諷（DMS0)和硫酸錠W降低堿基錯配水 平，提高富含GC模板的擴(kuò)增效率。運(yùn)可能與消除引物和模板的二級結(jié)構(gòu)，降低DNA解鏈溫 度使DM變性完全有關(guān)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于測定人TERF1基因rs201882345位點(diǎn)多 態(tài)性的試劑盒，其包含：
[0030] 用于PCR擴(kuò)增人TERF1基因rs201882345位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物， 其中上游引物具有錯配堿基G W獲得含GATTM片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中Μ為人TERF1基因 rs201882345位點(diǎn)上的待定堿基A或C ; W及 陽〇3U 僅能夠切開GATTA片段與GATTC片段之一的限制性內(nèi)切酶。 陽03引上述試劑盒中還可W包括其它成分，例如PCR反應(yīng)Mix(包括4種dNTP混合物、Mg2\Taq DNA polymerase、Taq Antibody、緩沖液，DMS0和硫酸錠）和用于實(shí)施測定的說明 書等。
[0033] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解，除非有明顯抵觸，本發(fā)明的第一方面和第二方面的相 關(guān)特征可W相互組合。
[0034] 本發(fā)明的測定手段不但快速可靠，而且測定成本大大降低。
【附圖說明】
[00對圖1描述了根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的酶切產(chǎn)物電泳紫外照片。其中Marker是：標(biāo) 準(zhǔn)參考位置；泳道1 :AA基因型；泳道2 :AC基因型；泳道3 :CC基因型。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，W下詳細(xì)描述僅用于說 明而非限定本發(fā)明。
[0037] (1)待測DNA的獲取
[0038] 采集不同人群外周血，提取基因組DNA后進(jìn)行下面的TERF1基因rs201882345位 點(diǎn)多態(tài)性的測定。
[0039] 對于待測DNA的選擇，本發(fā)明并沒有特別的限制。既可W是從人體的體液或者組 織獲得離體樣本，還可W是經(jīng)過預(yù)先降解處理的基因組。為了方便實(shí)施，通常優(yōu)選從血液提 取離體樣本。其中所述的組織包括人體中含有全部或至少TERF1基因的組織，而與是否表 達(dá)該TERF1基因無關(guān)。從體液和/或組織中提取DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并 且可W參考常用的分子生物學(xué)手冊，例如《分子克隆》第2版進(jìn)行。 W40] 0)引物設(shè)計(jì)與合成
[0041] 查找NCBI網(wǎng)站的Gene數(shù)據(jù)庫和SNP數(shù)據(jù)庫，分別獲得TERF1基因全序列和 rs201882345多態(tài)位點(diǎn)信息。
[0042]rs201882345多態(tài)位點(diǎn)m前后部分堿基序列（堿基序列W5' 一 3'表示，大小寫意 義相同）如下（SEQIDNO:1):
[0043]
W44] 根據(jù)基因序列進(jìn)行上游引物和下游引物設(shè)計(jì)，其中，上游引物引入錯配堿基。在最 終所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物的錯配堿基G與Μ之間相隔Ξ個堿基ATT。
[0045] 在本發(fā)明中，上游引物具有錯配堿基G，且長度為35~60bp。其中一個實(shí)施例中， 引物如下，
[0046]上游引物：5'TGGCAACTTT AAAGAAGCAG AAGAAGTCTT TGAAAGAATA TTTGGTGATC CAGATT 3' (SEQ ID NO :2),
[0047]下游引物：5'176〔4〔66了4 17417口'4了4阿61'口'3'（沈9 10側(cè):3)，其中上游引物下 劃線堿基為錯配堿基。 柳48] 0)制備PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
[0049] 根據(jù)上游引物和下游引物特征及PCR相應(yīng)試劑制定PCR擴(kuò)增程序和條件，制備 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中一個實(shí)施例中，取基因組DNA(50~80ng)、上下游引物（終濃度為 0. 1 ~1μΜ)、2XPCRMix7. 5μL(包括 4 種dNTP混合物、Mg2\TaqDNApolymerase、Taq Antibody、緩沖液，DMSO和硫酸錠）和雙蒸水共同組成15μL反應(yīng)體系，調(diào)整溶液抑為7. 3 左右。PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性30s，95°C變性80s- 63°C退火80s- 72°C延伸20s共 30個循環(huán)，72°C延伸7min。PCR反應(yīng)后獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0050] (4)酶切反應(yīng)
[0051] 本發(fā)明可W采用Hinfl和Tfil內(nèi)切酶，為TERF1基因rs201882345位點(diǎn)的多態(tài)鑒 定提供了多種可選擇的內(nèi)切酶，實(shí)驗(yàn)時可W根據(jù)市場價(jià)格選擇合適的內(nèi)切酶。目前部分內(nèi) 切酶價(jià)格比較低廉，如表1所示。
[0052] 表1肥B公司幾種內(nèi)切酶識別序列及其價(jià)格 [00531
[0054] 其中一個實(shí)施例中，取PCR產(chǎn)物10化，加入抓內(nèi)切酶化η??、2μΙ10X酶切緩沖 液和7. 5μL雙蒸水組成20μL反應(yīng)體系，37°C水浴中酶切4~12h，即得酶切產(chǎn)物，酶切產(chǎn) 物經(jīng)1倍濃縮后電泳觀察。 陽〇5引 妨電泳測試
[0056] 其中一個實(shí)施例中，PCR產(chǎn)物經(jīng)Hinfl酶切后如果不能切開則仍為189bp，如果被 切開則出現(xiàn)136bp和53bp(由于Hinfl酶切產(chǎn)生粘性末端使其互補(bǔ)鏈堿基數(shù)目不同，因此 切開后片段長度W基因序列上單鏈堿基數(shù)目為準(zhǔn)來計(jì)算），其中53bp片段電泳圖中難W分 辨。
[0057] 將酶切產(chǎn)物在2~4%瓊脂糖凝膠中3~8V/cm條件下，電泳30-80min，于紫外燈 下拍照測定。酶切電泳圖見圖1，依據(jù)189bp和136bp片段的有無判斷來判斷基因型：AA型 為189bp-個片段，AC型有189bp、136bp片段，CC型為136bp-個片段。
[0058] 下面是實(shí)施本發(fā)明的若干實(shí)施例。
[0059] 實(shí)施例1提取人外周血白細(xì)胞DNA測定rs201882345多態(tài)性 W60] 1材料與方法
[0061] 1. 1主要試劑及儀器
[0062] 試劑：2XPCR Mix(包括4種dNTP混合物、Mg2\Taq DNA polymerase、Taq Antibody、緩沖液，DMSO和硫酸錠），限制性內(nèi)切酶化nfl(肥B公司），瓊脂糖度iowest公 司），引物由上海Sangon公司合成。