lOmin。
[0096] 酶切鑒定同實(shí)施例1。
[0097]結(jié)果：
[0098] 擴(kuò)增后序列（位于SEQIDNO:1堿基序列的458-642處，185bp)，所獲得的擴(kuò)增產(chǎn) 物序列如下（SEQIDNO:9):
[0099]
[0100] 擴(kuò)增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為上游、下游引物所對(duì)應(yīng)的序列，r代表A/G多態(tài)即 SNP位點(diǎn)rs662。 陽101] 經(jīng)內(nèi)切酶化q°I酶切后的產(chǎn)物序列分別如下： 陽102] 該多態(tài)位點(diǎn)含有G等位基因時(shí)PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段143bp(該片段下 游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少2個(gè)堿基）序列（SEQIDNO:10): 陽103]
[0104] 該多態(tài)位點(diǎn)含有G等位基因時(shí)PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段42bp(該片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2個(gè)堿基）序列（SEQIDNO:11):
[0105]ttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttt 42
[0106] 酶切產(chǎn)物電泳后于紫外燈下拍照鑒定，rs662位點(diǎn)擴(kuò)增后出現(xiàn)185bp片斷。經(jīng) TacTI酶切后電泳會(huì)出現(xiàn)18化P、143bp、42bpΞ種片段（其中42bp在電泳圖中不易分辨）。 陽107] 酶切后電泳進(jìn)行基因型判斷：AA型為185bp-個(gè)片段，AG型有185bp和143bp兩 種片段，GG型為143bp-個(gè)片段。 陽108] 共檢測(cè)96例人員，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs662位點(diǎn)出現(xiàn)AA型16例、AG型50例和GG型 30例。
[0109] 實(shí)施例3人外周血血凝塊標(biāo)本測(cè)定P0N1基因rs662多態(tài)性
[0110] 主要試劑及儀器同實(shí)施例1。參考《分子克隆技術(shù)》中酪-氯仿抽提法提取血凝塊 基因組DNA。 陽11UPCR反應(yīng)所采用的上游引物是沈QNO: 12,下游引物是沈QNO: 13。
[0112]上游引物：5'ACTTTTATGG CACAAATGAT CACTATTTTC TTGACCCCTA CTT工C3'（SEQID NO:12)；
[0113]下游引物：5'TCCTTCTGCC ACCACTC3'（沈Q IDN0:13)
[0114]PCR擴(kuò)增除退火溫度是57°C外，其余反應(yīng)條件同實(shí)施例1 ;酶切反應(yīng)條件同實(shí)施例 1。酶切產(chǎn)物經(jīng)1倍濃縮后在2.5%瓊脂糖凝膠5V/cm條件下，電泳35min，于紫外燈下拍照 鑒定。 陽115] 結(jié)果：
[0116] 擴(kuò)增后序列（位于SEQ ID NO :1堿基序列的456-583處，共128bp)，所獲得的擴(kuò) 增產(chǎn)物序列如下（SEQ ID N0:14): 陽117]
[0118] 擴(kuò)增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為上游、下游引物所對(duì)應(yīng)的序列，r代表A/G多態(tài)即 SNP位點(diǎn)rs662。
[0119] 酶切后的產(chǎn)物序列分別如下：
[0120] 該多態(tài)位點(diǎn)含有G等位基因時(shí)PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段84bp(該片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少2個(gè)堿基）序列（SEQIDNO:15):
[0121]
[0122] 該多態(tài)位點(diǎn)含有G等位基因時(shí)PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段44bp(該片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2個(gè)堿基）序列（SEQIDNO:16):
[0123]acttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttt 44
[0124] 酶切產(chǎn)物電泳后于紫外燈下拍照鑒定，rs662位點(diǎn)擴(kuò)增后出現(xiàn)128bp片斷。經(jīng) Taq°I酶切后電泳會(huì)出現(xiàn)128bp、84bp、44bpΞ種片段（其中44bp在電泳圖中不易分辨）。 陽1巧]酶切后電泳進(jìn)行基因型判斷：AA型為128bp-個(gè)片段，AG型有128bp和84bp兩種 片段，GG型為84bp-個(gè)片段。 陽126] 多態(tài)結(jié)果：共檢測(cè)80例人員，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs662位點(diǎn)出現(xiàn)AA型15例、AG型41 例和GG型24例。 陽127]實(shí)施例4人口腔黏膜細(xì)胞測(cè)定P0N1基因rs662多態(tài)
[0128] 主要試劑及儀器同實(shí)施例1。參考《分子克隆技術(shù)》中酪-氯仿抽提法提取口腔黏 膜細(xì)胞基因組DNA。 陽129] PCR反應(yīng)所采用的上游引物是沈Q NO: 17,下游引物是沈Q NO: 18。 陽130]上游引物：5'AGCACTTTTA TGGCACMAT GATCACTATT TTCTTGACCC CTACTT王C3'（沈Q IDNO:17)； 陽13U 下游引物：5'TCCATTAGCAAAATCAAATCCTTCT3'（沈QIDNO:18)
[0132] PCR擴(kuò)增除退火溫度是60°C外，其余反應(yīng)條件同實(shí)施例1 ;酶切反應(yīng)條件同實(shí)施例 1。上述酶切產(chǎn)物經(jīng)1倍濃縮后在3. 5%瓊脂糖凝膠5V/cm條件下，電泳50min，于紫外燈下 拍照鑒定。 陽133]結(jié)果：
[0134] 擴(kuò)增后序列（位于SEQIDNO:1堿基序列的453-601處，共149bp)，所獲得的擴(kuò) 增產(chǎn)物序列如下（SEQIDN0:19): 陽135]
陽136] 擴(kuò)增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為上游、下游引物所對(duì)應(yīng)的序列，r代表A/G多態(tài)即 SNP位點(diǎn)rs662。 陽137] 酶切后的產(chǎn)物序列分別如下：
[0138] 該多態(tài)位點(diǎn)含有G等位基因時(shí)PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段10化P(該片段下 游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少2個(gè)堿基）序列（SEQIDNO:20): 陽139]
[0140] 該多態(tài)位點(diǎn)含有G等位基因時(shí)PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段47bp(該片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加2個(gè)堿基）序列（SEQIDNO:21):
[0141]agcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttt 4了
[0142] 酶切產(chǎn)物電泳后于紫外燈下拍照鑒定，rs662位點(diǎn)擴(kuò)增后出現(xiàn)149bp片斷。經(jīng) Taq°I酶切后電泳會(huì)出現(xiàn)149bp、102bp和47bpS種片段（其中47bp在電泳圖中不易分 辨）。
[0143] 酶切后基因型判斷：AA型為149bp-個(gè)片段，AG型有149bp和102bp兩種片段， GG型為102bp-個(gè)片段。
[0144] 多態(tài)結(jié)果：共檢測(cè)78例人員，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs662位點(diǎn)出現(xiàn)AA型12例、AG型40 例和GG型26例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定人P0N1基因rs662位點(diǎn)多態(tài)性的方法，包括： 提供待測(cè)人基因組DNA; 提供擴(kuò)增人P0N1基因rs662位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有 錯(cuò)配堿基T; 以所述待測(cè)人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以獲得 含TCRA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中R為人P0N1基因rs662位點(diǎn)上的待定堿基A或G; 提供限制性內(nèi)切酶； 利用限制性內(nèi)切酶對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以及 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人P0N1基因rs662位點(diǎn)上的待定堿基R是A還是G， 其中，限制性內(nèi)切酶為僅能夠切開TCGA片段與TCAA片段之一的限制性內(nèi)切酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物的錯(cuò)配堿基T與R之 間相隔一個(gè)堿基C。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與R相鄰。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中限制性內(nèi)切酶為僅能切開TCGA片段的TaqαI或 其同裂酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類型：具有總片段長 度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物、切斷后具有較長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物以及切斷后具有較短片段的擴(kuò)增產(chǎn) 物，通過判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人Ρ0Ν1基因rs662位點(diǎn)上的待定堿基R是 A還是G。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝膠電泳 聯(lián)合紫外燈拍照后與參照?qǐng)D對(duì)比來進(jìn)行的。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中參照?qǐng)D是擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時(shí)間后經(jīng) 紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照?qǐng)D像位置和第二參照?qǐng)D像位置，其中第一參照?qǐng)D像位 置針對(duì)的是未切斷的總片段長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，而第二參照?qǐng)D像位置則針對(duì)的是切斷后具有 較長片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過設(shè)計(jì)上游引物和下游引物的長度而使得擴(kuò)增 產(chǎn)物的總片段長度在l〇〇bp至300bp之間，并且下游引物的片段長度至少為35bp，使得酶切 切掉部分片段占總片段的長度的百分比超過20%。9. 一種用于測(cè)定人P0N1基因rs662位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，其包含： 用于PCR擴(kuò)增人P0N1基因rs662位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物 具有錯(cuò)配堿基T以獲得含TCRA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中R為人P0N1基因rs662位點(diǎn)上的待 定堿基A或G;以及 僅能夠切開TCGA片段與TCAA片段之一的限制性內(nèi)切酶。
【專利摘要】人PON1基因rs662位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒。該方法包括：提供待測(cè)人基因組DNA；提供擴(kuò)增人PON1基因rs662位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有錯(cuò)配堿基T；以所述待測(cè)人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以獲得含TCRA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中R為人PON1基因rs662位點(diǎn)上的待定堿基A或G；提供限制性內(nèi)切酶；利用限制性內(nèi)切酶對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以及根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人PON1基因rs662位點(diǎn)上的待定堿基R是A還是G。限制性內(nèi)切酶為僅能夠切開TCGA片段與TCAA片段之一的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明的測(cè)定手段不但快速可靠，而且測(cè)定成本大大降低。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105256008
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510615704
【發(fā)明人】楊永利, 施學(xué)忠, 杜玉慧, 賈曉燦, 靳慧鳴, 王瑩, 段曉冉, 馮曉蕾, 姚武, 王威
【申請(qǐng)人】鄭州大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年9月24日