化向引物和反向引物)，每條擴(kuò)增引物的濃 度均為10umol/L;對(duì)應(yīng)于EGFR基因的第18、19、20和21號(hào)外顯子，每個(gè)外顯子各自都有一 組祀向其上目標(biāo)位點(diǎn)（即屬可發(fā)生29種常見(jiàn)突變的位點(diǎn))的連接引物，每條連接引物的濃度 均為lOumol/L;耐熱DNA連接酶的酶活力單位濃度不低于4000U/祉，在正常體系下95°C保 溫比酶活力不低于原酶活的60%; 10X耐熱DNA連接酶緩沖液為200mlTris-肥1、250ml 乙酸鐘、100ml乙酸儀、10mlNAD(煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸)、100mlDTT(二硫蘇糖醇)、 1〇/〇TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基酸)，pH=7.6。
[0016] 其中，步驟（2)中外顯子組合的擴(kuò)增引物和連接引物及相關(guān)信息如表3所示： 表3EGFR外顯子的擴(kuò)增引物和擴(kuò)增片段大小W及連接引物和針對(duì)的突變類(lèi)型信息

如表3所示，采用組合多重?cái)U(kuò)增可W在保證29種突變檢測(cè)的前提下，最大程度減少所 需要的檢測(cè)管數(shù)，從而簡(jiǎn)化操作和節(jié)約成本。對(duì)應(yīng)于表3,擴(kuò)增引物和連接引物的序列及祀 向信息如表4所示： 表4擴(kuò)增引物和連接引物序列及祀向信息

表4中沈αIDNO. 9、11、13、15、17、19、21、23和25的5'端的第一個(gè)核巧酸均進(jìn)行憐 酸化修飾，SEQ.IDNO. 10、12、14、16、18、20、22、24和26的5'端和3'端的第一個(gè)核巧酸均 進(jìn)行憐酸化修飾。
[0017] 其中，步驟（2)中提供的是針對(duì)25uL的體系的組分及含量，可W作為其它體系如 50uL等體系的配制依據(jù)。
[0018] 其中，步驟（3)中瓊脂糖凝膠電泳的樣品上樣量不少于15ul，對(duì)照體系擴(kuò)增出 的目的片段其電泳條帶亮度用肉眼觀察，應(yīng)不低于DNAMarker的標(biāo)準(zhǔn)條帶亮度(一般為 5-lOng/uL)則表示擴(kuò)增效果良好；此外由DNAMarker各標(biāo)準(zhǔn)條帶的濃度，如某一片段為 lOng/uL則在同樣上樣量的情況下，只選擇亮度與該標(biāo)準(zhǔn)條帶相當(dāng)?shù)哪康臈l帶進(jìn)行割膠回 收(濃度低于lOng/uL的目的條帶不進(jìn)行割膠回收)，如需要可借助凝膠成像系統(tǒng)自帶的軟 件或者美國(guó)BioRad公司的如antity-one等凝膠分析軟件進(jìn)行條帶亮度分析。
[0019] 其中，步驟（4)中DNA片段的測(cè)序只需按照Sanger測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行即可，并 無(wú)進(jìn)一步改進(jìn)或者變動(dòng)；因此可W根據(jù)實(shí)際需要，按照要求送割膠回收產(chǎn)物到具有資質(zhì)巧曰 臨床基因分析資質(zhì)）的檢測(cè)機(jī)構(gòu)或公司進(jìn)行測(cè)定，值得注意的是需要測(cè)序單位提供測(cè)序的 原始數(shù)據(jù)報(bào)括峰圖，W便根據(jù)自身需求進(jìn)一步分析和解讀。
[0020] 其中，步驟（5)中作為突變判定的野生型的EGFR基因及其第18、19、20和21號(hào) 外顯子序列參照序列AY588246 (GeneBank登錄號(hào)）；對(duì)應(yīng)于序列AY588246,第18、19、20 和21號(hào)外顯子序列的起止區(qū)域分別為156750-156872、157551-157649、164123-164308和 174552-174707。
[0021] 其中，步驟（5)中可直接判定為野生型的樣本，仍可W將正常體系擴(kuò)增的目的基因 片段進(jìn)行割膠測(cè)序，進(jìn)一步確證。
[0022] 其中，步驟（5)中雙向測(cè)序結(jié)果均為同一未知差異位點(diǎn)假設(shè)為腺嚷嶺核巧酸A，如 有需要?jiǎng)t可取正常細(xì)胞如血細(xì)胞(血液癌患者除外）當(dāng)成基準(zhǔn)，按照常規(guī)方法測(cè)定其對(duì)應(yīng)的 EGFR基因片段序列：如果正常細(xì)胞測(cè)出的結(jié)果也為A則判定為多態(tài)性，如果測(cè)出非A的結(jié) 果則判定為未知突變。
[002引其中，步驟（5)中如果需要重新檢測(cè)EGFR基因突變情況（即雙向測(cè)序結(jié)果均為野 生型或一向?yàn)橐吧鸵幌驗(yàn)橥蛔冃停┑?，若再次采用本發(fā)明方法檢測(cè)仍無(wú)法判定突變情況 的，則可W建議改用其它測(cè)定方法。
[0024]其中，步驟（5)中根據(jù)得到的樣品EGFR基因檢測(cè)結(jié)果后，對(duì)照現(xiàn)有的臨床結(jié)論或 科研研究成果，臨床醫(yī)生告知對(duì)應(yīng)的腫瘤患者預(yù)測(cè)其接受祀向藥物治療的受益情況。
[00巧]其中，步驟（5)中腫瘤患者包括非小細(xì)胞肺癌但不限定于此，祀向藥物包括吉非替 尼和厄羅替尼但不限定于此。針對(duì)非小細(xì)胞肺癌，EGH?各單一突變和祀向藥物吉非替尼和 厄羅替尼使用的受益情況為：20外顯子發(fā)生T790M突變和插入，將預(yù)測(cè)TKI藥物的耐藥或 者無(wú)效；其余突變均預(yù)測(cè)TKI藥物治療有效。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是，基于Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類(lèi)EGFR基因突變的方法及其 試劑盒，由于在EGFR基因片段擴(kuò)增體系中引入耐熱DNA連接酶和針對(duì)突變位點(diǎn)的特定連 接引物體系，極大抑制了樣品中的野生型EGFR基因的擴(kuò)增，可W基于擴(kuò)增片段條帶直接判 定野生型樣本；或使得低突變含量樣品其最終的PCR產(chǎn)物中突變片段的比例高于50%，從 而保證了Sanger測(cè)序?qū)τ陔s合基因片段體系的準(zhǔn)確識(shí)別；本發(fā)明方法及試劑盒可W基于 Sanger測(cè)序檢測(cè)出樣本中含量低至1%的EGFR基因突變，準(zhǔn)確率極高，檢測(cè)費(fèi)用低廉并且還 可能測(cè)出新的未知突變。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1是本發(fā)明基于連接抑制方法的原理示意圖。圖中"野"代表野生型基因組模 板，"突"代表突變型基因組模板(其上的米字符號(hào)代表突變位點(diǎn))，箭頭代表擴(kuò)增引物及其 延伸方向，L和R代表連接引物(其上的實(shí)屯、原點(diǎn)代表憐酸化修飾)，Ξ角形代表DNA聚合酶， 圓圈代表DNA連接酶，退火53 °C前的波浪號(hào)代表約等于，退火階段L連接引物右端翅起代 表其和突變位點(diǎn)不配對(duì)，延伸階段擴(kuò)增引物延伸出的虛線箭頭代表DNA鏈延伸，延伸階段 連接引物右上角的傾斜虛箭頭代表連接引物脫離突變型基因組模板，長(zhǎng)連接引物是連接引 物L(fēng)和R經(jīng)過(guò)DNA連接酶作用連接而成的。
[0028] 圖2是EGFR18的G719A突變雜合體樣本擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。Μ代表DNAMarker, 緊接著Marker的泳道1-5分別為對(duì)照體系的1-5管的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道6-10分別為正常體 系的1-5管的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0029] 圖3是EGFR18的G719A(6239)雜合體測(cè)序峰圖局部，圖中圓圈和箭頭標(biāo)識(shí)處可見(jiàn) 發(fā)生了GC的轉(zhuǎn)換。
[0030] 圖4是EGFR19的L747_S752del(6255)雜合體測(cè)序峰圖局部，圖中圓圈和箭頭 標(biāo)識(shí)處可見(jiàn)發(fā)生了缺失。
[0031] 圖5是EGFR20的T790M(6240)雜合體測(cè)序峰圖局部，圖中圓圈和箭頭標(biāo)識(shí)處可見(jiàn) 發(fā)生了GA(或CT)的顛換。
【具體實(shí)施方式】
[003引一、基于Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類(lèi)EGFR基因突變的方法及其試劑盒的原理 Sanger測(cè)序法是基因多樣性/突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，目的基因片段是通過(guò)祀向其兩端保 守區(qū)域的引物對(duì)擴(kuò)增得到的；對(duì)于復(fù)合模板如雜合子來(lái)源的核酸樣本，若其中的擴(kuò)增片段 含量有小于10%的則難W通過(guò)測(cè)序準(zhǔn)確識(shí)別該片段。腫瘤是體細(xì)胞疾病，由于體細(xì)胞突變 組分只占臨床等樣本中的一部分，除此之外還可能存在大量的野生型基因，因此采用常規(guī) 的Sanger測(cè)序無(wú)法保證此類(lèi)樣本基因突變檢測(cè)的靈敏度需求。
[0033] 針對(duì)Sanger測(cè)序法在EGFR基因突變檢測(cè)中的不足，本發(fā)明提出了連接抑制的方 法進(jìn)行改進(jìn)，圖1是其原理示意圖。本發(fā)明WEGFR基因的29種常見(jiàn)突變?yōu)閷?duì)象，設(shè)計(jì)了祀 向各突變位點(diǎn)的連接引物（SEQ.IDNO. 9-SEQ.IDNO. 18)，使得各對(duì)連接引物和野生型基 因?qū)?yīng)突變位點(diǎn)的區(qū)域郵鄰互補(bǔ)輛條連接引物都和模板完全互補(bǔ)并且郵鄰)。由于在EGFR 基因外顯子的擴(kuò)增體系中引入了耐熱的DNA連接酶，則退火階段（~50°C)時(shí)DNA連接酶將 會(huì)連接位于野生型模板上的郵鄰互補(bǔ)引物形成長(zhǎng)的連接引物，而由于與突變型模板結(jié)合的 兩條連接引物在郵鄰處（即突變位點(diǎn)處）沒(méi)有和模板完全互補(bǔ)則不被連接。當(dāng)體系處于下 一階段即72°C延伸時(shí)，由于結(jié)合于野生型模板上的長(zhǎng)連接引物退火溫度高于72°C，因此仍 位于原處從而阻止野生型模板的擴(kuò)增