一種檢測血清中l(wèi)ncARSR的試劑盒及其在檢測腎癌舒尼替尼耐藥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測血清中IncARSR的試劑盒 及其在檢測腎癌舒尼替尼耐藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎癌（renalcellcarcinoma,RCC)在中國的發(fā)病率位居泌尿系統(tǒng)腫瘤第二位。 約20-30%的腎癌患者在診斷時已經(jīng)處于晚期，原位腎癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的發(fā)生率則高 達30%。腎癌對傳統(tǒng)放療、化療不敏感，對白介素-2、干擾素-α等細胞因子治療的有效率 也不到20%，且副作用明顯。目前，W小分子抑制劑舒尼替尼為代表的受體型酪氨酸激酶 (RTK)抑制劑是晚期腎癌的主要治療手段。舒尼替尼是多祀點的酪氨酸激酶抑制劑，主要祀 向血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR)、血小板源性生長因子受體（PDGFR)、干細胞生長因子受 體化口)、FMS樣酪氨酸激酶3 (FLT3)等，具有抗血管生成和抑制腫瘤細胞生長的雙重作用。 雖然舒尼替尼能顯著縮減腎癌腫瘤體積，但大部分患者在治療6-15個月后會出現(xiàn)耐藥，使 舒尼替尼不能有效延長晚期腎癌患者的無進展生存期和總體生存期。因此，如果能在影像 學(xué)檢查之前及時監(jiān)測舒尼替尼耐藥的發(fā)生，可W避免進一步的無效治療，及時采取其他聯(lián) 合治療手段，提高治愈率。
[0003] 近年來，血清學(xué)標志物的篩選鑒定和在臨床診療中的應(yīng)用是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱 點。目前細胞因子和非編碼RNA中microRNA作為血清學(xué)標志物的研究取得了很大進展， 但是，長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)在血清學(xué)標志物中的應(yīng)用研究還較 少。IncRNA是長度大于200個堿基、無蛋白編碼功能的RNA。IncRNA參與調(diào)控腫瘤多方面 的特征，包括腫瘤生長、調(diào)亡、轉(zhuǎn)移、代謝等。研究表明IncRNA還可W調(diào)控腫瘤耐藥，但在 舒尼替尼耐藥中的作用尚不清楚。IncARSRQncRNAActivatedinRCCwithSunitinib Resistance,ENST00000424980)是本發(fā)明人在前期研究腎癌舒尼替尼耐藥中鑒定的新的 IncRNA,IncARSR位于人9號染色體，全長591個核巧酸。IncARSR作為血清學(xué)標志物的價 值至今尚未見文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種長鏈非編碼RNAIncARSR的用途，具體是IncARSR作 為腎癌舒尼替尼耐藥標志物的應(yīng)用，W及在制備腎癌舒尼替尼耐藥血清學(xué)檢測試劑或試劑 盒中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測血清中IncARSR的試劑盒，及該試劑盒在 腎癌舒尼替尼耐藥的血清學(xué)檢測中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明人在前期研究中，利用IncRNA忍片和RNAi技術(shù)篩選了與腎癌舒尼替尼耐 藥相關(guān)的IncRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IncARSR在耐藥細胞中高表達，并且高表達IncARSR的腎癌患者 對舒尼替尼反應(yīng)性差。
[0007] 進一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IncARSR可w通過外泌體的形式分泌出來，因此建立了 人血清中IncARSR的檢測方法和試劑盒，通過對接受舒尼替尼治療的腎癌病人血清的檢 測，我們發(fā)現(xiàn)耐藥病人血清中IncARSR表達水平明顯高于未出現(xiàn)耐藥的病人。因此，我們認 為，IncARSR具備作為腎癌舒尼替尼耐藥的血清學(xué)標志物的可能性。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種長鏈非編碼RNAIncARSR在制備腎癌舒尼替尼耐 藥診斷標志物中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第二方面，提供了IncARSR在制備腎癌舒尼替尼耐藥的檢測試劑或試劑 盒中的應(yīng)用。
[0010] 特別是，IncARSR在制備腎癌舒尼替尼耐藥的血清學(xué)檢測試劑或檢測試劑盒中的 應(yīng)用。
[0011] 所述的檢測試劑或檢測試劑盒，是通過原位雜交、實時定量PCR技術(shù)等方法檢測 生物樣品中IncARSR的表達量。
[0012] 所述的檢測試劑或檢測試劑盒，包括：對IncARSR具有檢測特異性的探針、基因忍 片，或PCR引物等。
[0013] 所述的生物樣品選自：獲自對象的新鮮組織或細胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組 織或細胞、血液或體液等。優(yōu)選為血清。
[0014] 所述的檢測試劑或試劑盒，優(yōu)選為通過實時定量PCR技術(shù)檢測血清中IncARSR的 表達量。 陽01引所述的對IncARSR具有檢測特異性的PCR引物如下：
[0016] 上游引物：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT(沈QIDN0:1);
[0017] 下游引物：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA(SEQIDN0:2)。
[0018] 本發(fā)明的第Ξ方面，提供了一種檢測血清中IncARSR的試劑盒，該試劑盒的組成 包括：
[0019] 1.RNA抽提系統(tǒng)
[0020] 由外源標準RNA(λpolyA+RNA-A)、mirVana?PARISTMKit組成；
[0021] 2.逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)
[0022] 由隨機引物N6、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄體系緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑組成； 陽〇2引 3.引物系統(tǒng)
[0024] 由1對檢測λpolyA的Real-timePCR引物和1對特異性檢測IncARSR的Real-timePCR引物組成，IncARSR的引物序列為： 陽0巧]上游引物：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT(沈QIDNO: 1);
[0026] 下游引物：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA(SEQIDN0:2);
[0027] 4.擴增系統(tǒng)
[0028] 由SYBRPremixExTaq?試劑組成。
[0029] 本發(fā)明的第四方面，提供了上述用于檢測血清中IncARSR的試劑盒的檢測方法， 具體步驟如下：
[0030] 1.按常規(guī)方法抽血并取血清；
[0031] 2.向血清中加入外源標準RNA工作液，然后抽提血清中的小RNA; 陽〇3引 3.用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA; 陽03引 4.用擴增系統(tǒng)進行Real-timePCR擴增，測定IncARSR的含量。
[0034] 本發(fā)明的第五方面，提供了上述的檢測血清中IncARSR的試劑盒在制備腎癌舒尼 替尼耐藥的檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[00對本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0036] 本發(fā)明提供了IncARSR作為腎癌舒尼替尼耐藥的血清學(xué)標志物，為診斷腎癌舒尼 替尼耐藥提供了新的臨床手段，有助于對臨床舒尼替尼藥物療效的監(jiān)測，避免進一步的無 效治療，具有良好的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)前景。
【附圖說明】
[0037] 圖1為舒尼替尼耐藥細胞7SuR(A)和ACSuR度）干擾IncRNA后的IC50檢測；
[0038] 圖2為舒尼替尼敏感與耐藥腎癌病人血清中IncARSR的表達檢測；
[0039] 圖3為血清IncARSR高水平與低水平的舒尼替尼治療病人的無進展生存曲線。
【具體實施方式】
[0040] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0041] 實施例1 :IncARSR的篩選、鑒定 陽0創(chuàng)我們前期構(gòu)建了舒尼替尼耐藥的腎癌細胞株7SuR、ACSuR(保藏號：CCTCC C2014217，CCTCCC2014238)，并已申請了中國發(fā)明專利CN201510304372.8,發(fā)明名稱為"腎 癌舒尼替尼耐藥細胞系及其構(gòu)建方法"。
[0043] 為了研究舒尼替尼耐藥相關(guān)的IncRNA，我們對腎癌親本細胞和耐藥細胞采用 IncRNA忍片分析，篩選到8條升高最顯著的IncRNA。進一步地，我們采用RNAi技術(shù)對8條 IncRNA進行功能驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾IncARSR使耐藥細胞恢復(fù)了對舒尼替尼的敏感性（圖 1)。W上結(jié)果提示了IncARSR在腎癌舒