用于梨輪紋病菌檢測的引物對(duì)及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一項(xiàng)用于梨輪紋病菌檢測的引物對(duì)及 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 梨輪紋病，亦稱粗皮病，在我國各梨產(chǎn)區(qū)分布廣泛，是我國梨樹的重要病害之一。 該病主要危害梨樹枝干、果實(shí)和葉片，枝干受害可促使樹枝早衰，葉片受害會(huì)引起葉片早 落，果實(shí)受害能造成大量爛果，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。我國每年因?yàn)槔孑喖y病造成梨果減產(chǎn) 約25%，嚴(yán)重時(shí)爛果率超過80%。梨輪紋病菌（《ο?巧?邱AseriaAereweriana)寄主范圍廣， 除梨外，還能危害蘋果、桃、李、杏、海棠等多種果樹。
[0003] 傳統(tǒng)的檢測植物病害的方法包括直接觀察植物組織的發(fā)病癥狀或者分離得到病 原物后再進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。然而直接觀察會(huì)遺漏發(fā)病初期未表現(xiàn)出癥狀的情況，且依賴形 態(tài)學(xué)檢測方法易受到人為因素和環(huán)境條件的干擾，加之傳統(tǒng)的分類方法耗時(shí)長，程序繁瑣， 不適合快速檢測的要求，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)病害發(fā)生的及時(shí)監(jiān)測和有效控制病原菌的傳播及病害 流行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供用于梨輪紋病菌檢測的引物對(duì)和方法。 陽005] 本發(fā)明根據(jù)GenBank中登記的輪紋病菌不同種的ITS序列差異，用Prime巧軟件 設(shè)計(jì)了梨輪紋病菌特異性引物對(duì)BsFl/BsR2,其序列分別為SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2， 對(duì)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增，比較了常規(guī)PCR和巢式PCR的檢測靈敏度，并對(duì)果園采集的感病梨樹 組織(枝條、葉片和果實(shí)）中的梨輪紋病菌進(jìn)行了快速檢測，具有特異性好、靈敏度高且耗時(shí) 短等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 所述梨輪紋病菌檢測引物對(duì)對(duì)梨輪紋病菌特異性擴(kuò)增出一條332bp的條帶。
[0007] 本發(fā)明所述的引物對(duì)對(duì)梨輪紋病菌的檢測方法為梨輪紋病菌提取出的的DNA 為模版，利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中 電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并進(jìn)行判定。
[000引本發(fā)明提供一種具體的普通PCR檢測方法：PCR反應(yīng)總體積為25化，包括：模板DNA1化、0. 5μL上游引物、0. 5μL下游引物、0. 5μ1χΙΝΤΡ、2. 5 化 10XBuffer、2μL Mg2+、0. 5μLrTaq酶、17. 5μΙd地 20;PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30 s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。
[0009] 本發(fā)明提供一種W梨輪紋病菌提取出的的DM為模版，w真菌通用引物口SI/ 口S4作為第一輪PCR反應(yīng)引物與特異引物BsFl/BsR2作為第二輪PCR反應(yīng)引物結(jié)合的方 式進(jìn)行巢式PCR檢測方法。第一輪PCR反應(yīng)的混合液總體積為25化，包括：模板DNA1化、 0.5μL上游引物ITSU0.5μL下游引物ITS4、0.5yLdNTP、2.5ML10XBuffer、2μL Mg2+、0. 5μLrTaq酶、17. 5μΙd地 20;PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30 s，56°C退火30s，72°C延伸Imin，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。取1化第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)；第二輪PCR反應(yīng)的混合液總體積為25化，包括： 第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物1化、0. 5μL上游引物BsFl、0. 5μL下游引物BsR2、0. 5yLdNTP、 2. 5 化 10XBuffer、2μLMg2+、0. 5μLrTaq酶、17. 5μΙd地 20;PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸Imin，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 7min〇
[0010] 本發(fā)明所述的引物對(duì)檢測的祀序列為rDNA-ITS區(qū)，其是介于18srDNA、5.8srDNA 和28srDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進(jìn)化速率較編碼區(qū)快，在種內(nèi)不同菌株間高度保守，而在種 間存在著豐富的變化，屬于理想的祀序列。通過本發(fā)明所述引物對(duì)進(jìn)行檢測，具有特異性 好、靈敏度高且耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，為病害發(fā)生的及時(shí)檢測和有效控制起到了重要的作用。
【附圖說明】 陽0川 圖1特異性引物BsFl/BsR2PCR擴(kuò)增么Aere邸eria打a電泳； 圖2特異性引物BsFl/BsR2PCR擴(kuò)增其他菌株產(chǎn)物電泳； 圖3梨輪紋病菌常規(guī)PCR檢測； 圖4巢式PCR檢測梨輪紋病菌的靈敏度； 圖5常規(guī)PCR及巢式PCR檢測梨樹組織的梨輪紋病菌。
【具體實(shí)施方式】
[0012] W下通過具體實(shí)施對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
[0013] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登記的輪紋病菌不同種ITS序列差異，用Prime巧軟件設(shè)計(jì)了梨輪紋 病菌特異性引物BsFl/BsR2,設(shè)計(jì)序列為： BsFl：5' -CTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGG-3'； BsR2 :5'-GTGCCCAATACCAAGCAGAGCT-3' 。
[0014] 實(shí)施例2檢測方法 2. 1參試菌株如表1所不 表1參試菌株

2. 2DM的提取 2. 2. 1菌絲體的收集及其DM的提取 在28Γ恒溫培養(yǎng)箱中，PDA平板活化各菌株。活化后的菌株用滅菌的刀片在菌落邊緣 切割成1mm2的菌絲塊，轉(zhuǎn)移到液體PDA培養(yǎng)基中，放到28°C搖床中25化pm培養(yǎng)2~5天后， 過濾收集菌絲體，液氮冷凍研磨成菌絲粉，放入-20°C保存?zhèn)溆?。取少量菌絲粉用真菌小劑 量DNA提取試劑盒提取DNA(OMEGA公司生產(chǎn))。 陽01引 2. 2. 2菌絲DNA的快速提取 取一小塊菌絲塊放入1. 5血離屯、管中，加入0. 5mol/L化0H40~60μL，充分研磨 后，12000巧m離屯、5min,取5μL上清加入495化0. 1mol/LTris-cl(p冊(cè).0)混勻后 備用。
[0016] 2. 2. 3發(fā)病組織DNA的提取 方法同菌絲DNA的快速提取。取1g發(fā)病組織放入1. 5血離屯、管中，加入0. 5mol/L化OH50yL，充分研磨后，12000巧m離屯、5min,取5化上清加入495化0. 1mol/L Tris-cl(p冊(cè).0)混勻后備用。
[0017] 2. 3引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 2. 3.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登記的輪紋病菌不同種ITS序列差異，用Prime巧軟件設(shè)計(jì)了梨輪紋 病菌特異性引物BsFl/BsR2,如表2所示。 陽〇1引表2所用引物
2. 3. 2PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)總體積為25化，包括：模板DNA1化、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.5μ1χΙΝΤΡ、2. 5 化 10XBuffer、2μLMg2"、0. 5μLrTaq酶、17. 5μΙddH2〇;PCR擴(kuò)增程序 為：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取5化擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳30min(100V)， 在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照。
[0019] 為了提高引物BsFl/BsR2的檢測靈敏度，進(jìn)一步建立了巢式PCR反應(yīng)體系。W真菌 通用引物口S1^TS4作為第一輪反應(yīng)引物與特異引物BsFl/BsR2結(jié)合進(jìn)行巢式PCR。第一 輪PCR反應(yīng)的混合液總體積為25 μL^，包括：模板DNA 1化、0. 5 μ L上游引物、0. 5 μ L下游 引物、0.5 μ1χΙΝΤΡ、2.5化10XBuffer、2 yLMg化、0.5 yLrTaq酶、17.5μΙ ddH2〇;PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5 min，94°C變