鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的成套試劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的成套試劑及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 犬傳染性肝炎（Infectiouscanineh巧atitis,ICH)是由犬腺病毒I型（Canine adenovirusI，CAV-I)感染引發(fā)的犬的一種急性敗血性傳染病，該病于1925年首次被發(fā) 現(xiàn)，1984年，我國首次分離出該病毒CAV-I，在臨床上可導(dǎo)致犬傳染性肝炎、狐貍和熊腦炎 等疾病的發(fā)生。臨診W肝小葉中屯、壞死、肝實質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)包涵體W及出血 為特征，常引起急性壞死性肝炎和角膜混濁（即藍(lán)眼?。?。該病W剛離乳到一歲W內(nèi)的幼犬 感染率和死亡率為最高，死亡率高達(dá)40%，本病在世界范圍內(nèi)流行，既嚴(yán)重威脅著家養(yǎng)寵物 的身體健康，又對我國養(yǎng)犬業(yè)、皮毛動物養(yǎng)殖業(yè)等危害較大，給養(yǎng)犬業(yè)和寵物愛好者帶來巨 大的經(jīng)濟損失。
[0003] 犬傳染性肝炎病病毒屬于腺病毒科乳腺動物腺病毒屬，DNA型，直徑70-80納米。 病犬和帶毒犬是本病的傳染源。病犬的嘔吐物、唾液、鼻液、糞便和尿液等排泄物和分泌物 中都帶有病毒；康復(fù)犬可獲終生免疫，但病毒能在腎臟內(nèi)生存，經(jīng)尿長期排毒。犬傳染性肝 炎病病毒主要通過消化道感染，也可WW外寄生蟲為媒介傳染，但不能通過空氣經(jīng)呼吸道 感染。
[0004] 突然發(fā)病和出血時間延長是犬傳染性肝炎的暗示，重癥病例初期與犬?dāng)z熱極為相 似，僅靠臨床癥狀和病理變化難W進(jìn)行鑒別診斷，確診尚需依賴于實驗室特異性的診斷，如 病毒分離、血凝抑制試驗及皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)等檢測方法，而且還要與犬?dāng)z熱進(jìn)行鑒別診斷。針 對病毒核酸的檢測，無論從特異性、靈敏度還是檢測效率角度考慮都可視為最佳方法。
[0005] 傳統(tǒng)方法主要依賴病毒分離、病理學(xué)及血清學(xué)方法等，但運些方法不僅繁瑣耗 時，且敏感性和特異性較差，不能及時確診。近年來，由于核酸雜交、PCR等技術(shù)的應(yīng)用，使 CAV-I感染的診斷進(jìn)入到分子生物學(xué)階段，建立的PCR和real-timePCR方法需要昂貴的儀 器、一定要求的實驗室條件和經(jīng)過技能培訓(xùn)的技術(shù)人員。目前，PCR、巧光定量PCR、分子雜 交等技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用于各類疾病的快速診斷當(dāng)中，較高的檢測成本W(wǎng)及昂貴的檢測儀器 都限制了技術(shù)的推廣應(yīng)用。日本Notomi等（2000)建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技術(shù)，LAMP是在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的另外一種形式的核 酸擴增技術(shù)，利用4個特殊設(shè)計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，識別目的基因的特 定區(qū)域，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA的新技術(shù)，化gamine等于2002年通過對 LAMP檢測技術(shù)的改進(jìn)，引入1對環(huán)引物，大大提高了擴增效率。LAMP反應(yīng)結(jié)果的觀察方法 非常簡便，反應(yīng)結(jié)束后可通過肉眼在可見光或紫外線下直接觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定 結(jié)果。LAMP技術(shù)中，引物是決定檢測結(jié)果靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高鑒定犬傳染性肝炎病毒的靈敏度和特異 性。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的成 套試劑。
[0008] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的成套試劑，由名稱為FIP的 單鏈DNA、名稱為BIP的單鏈DNA、名稱為F3的單鏈DNA、名稱為B3的單鏈DNA、名稱為LF 的單鏈DNA和名稱為LB的單鏈DNA組成；
[0009] 所述FIP為核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 1的DNA;
[0010] 所述BIP為核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 2的DM;
[0011] 所述F3為核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 3的DNA;
[0012] 所述B3為核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 4的DNA;
[0013] 所述LF為核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 5的DNA;
[0014] 所述LB為核巧酸序列是序列表中SEQIDNo. 6的DM。
[0015] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的成套試劑中，所述FIP、所述BIP、所述 F3、所述B3、所述LF和所述LB的摩爾比可為4 :4 :1 :1 :4 :4。
[0016] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的成套試劑中，所述FIP、所述BIP、所述 F3、所述B3、所述LF和所述LB可各自獨立包裝，也可混合在一起。
[0017] 解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)。
[0018]本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)，含有所述成套試劑與 Μ;所述Μ為鏈置換型DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+和/或 徑基糞酪藍(lán)。
[0019] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)還可含有所述鏈置換型 DNA聚合酶為BstDNA聚合酶。。
[0020] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)可為環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試 劑或試劑盒。
[0021] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)還可含有利用環(huán)介導(dǎo)等 溫擴增鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒所需的儀器。
[0022] 具體來說，鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)可包括所述成套試劑W及進(jìn) 行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增所需要的其它試劑和儀器。鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)可 只由所述成套試劑組成，也可只由所述成套試劑與所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增所需要的其它 試劑組成，也可只由所述成套試劑與所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增所需要的儀器組成，也可只 由所述成套試劑、所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增所需要的其它試劑與所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 所需要的儀器組成。
[0023] 所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增所需要的其它試劑可為鏈置換型DNA聚合酶、反應(yīng)緩沖 液、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+和徑基糞酪藍(lán)中的至少一種。
[0024] 所述鏈置換型DNA聚合酶可為BstDNA聚合酶。所述BstDNA聚合酶可為肥B公 司產(chǎn)品。
[00巧]所述反應(yīng)緩沖液可為10XThermo化1ReactionBuffer可為肥BWewlingland Biol油s)公司貨號為M0275S的產(chǎn)品中試劑。
[0026] 所述甜菜堿可為Sigma公司產(chǎn)品。
[0027]所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP(即dNTPs)可為Invitrogen公司產(chǎn)品。
[002引所述Mg2可為MgSO4。
[0029] 所述徑基糞酪藍(lán)可為Sigma公司產(chǎn)品。
[0030] 所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增所需要的儀器可為恒溫儀，如恒溫水浴鍋。
[0031] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)中，所述鏈置換型DNA聚合酶為 BstDNA聚合酶。
[0032] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)中，所述系統(tǒng)可為環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 試劑或試劑盒。
[0033] 上述鑒定或輔助鑒定犬傳染性肝炎病毒的系統(tǒng)中，所述Mg2\所述甜菜堿、所述 dATP、所述dCTP、所述dGTP、所述dTTP、所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF、所述 LB和所述徑基糞酪的配比可為 2. 5mmol/L:0. 4mol/L:2mmol/L:2mmol/L:2mmol/L:2mmol/ L:0. 8μmol/L:0. 8μmol/L:0. 2μmol/L:0. 2μmol/L:0. 8μmol/L:0. 8μmol/L:0. 12mmol/ L。
[0034] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述成套試劑的制備方法。
[0035] 本發(fā)明所提供的所述成套試劑的制備方法，包括將所述FIP、所述BIP、所述F3、所 述B3、所述LF和所述LB分別單獨包裝的步驟。
[0036] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述系統(tǒng)的制備方法。
[0037] 本發(fā)明所提供的所述系統(tǒng)的制備方法，包括將所述FIP、所述BIP、所述F3、所述 B3、所述LF和所述LB分別單獨包裝的步驟。