羅丹明化合物及其作為熒光標(biāo)記物的用圖
【專利說(shuō)明】羅丹明化合物及其作為黃光標(biāo)巧物的用途
[0001] 本發(fā)明設(shè)及新的羅丹明化合物及其作為巧光標(biāo)記物的用途。該化合物可W在核酸 測(cè)序應(yīng)用中用作特別地用于核巧酸標(biāo)記的巧光標(biāo)記物。 柳〇引背景
[0003] 在本申請(qǐng)中參考若干出版物和專利文獻(xiàn)W便更充分地描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的 現(xiàn)狀。運(yùn)些出版物和文獻(xiàn)中的每個(gè)的公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0004] 利用巧光標(biāo)記物的核酸的非放射性檢測(cè)是分子生物學(xué)中的重要的技術(shù)。在重組 DNA技術(shù)中采用的許多程序之前嚴(yán)重依賴于用例如3中放射性地標(biāo)記的核巧酸或多核巧酸 的使用。放射性化合物允許核酸和其他感興趣的分子的靈敏的檢測(cè)。然而，在放射性同位素 的使用中有嚴(yán)重的限制，諸如它們的費(fèi)用、有限的儲(chǔ)存期化及更重要的安全考慮。排除對(duì)放 射性標(biāo)記物的需求提高了安全性，同時(shí)降低了與例如試劑處置相關(guān)的環(huán)境影響和成本。經(jīng) 得起非放射性巧光檢測(cè)的方法通過非限制性實(shí)例的方式包括自動(dòng)DNA測(cè)序、雜交法、聚合 酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)和免疫測(cè)定。 陽(yáng)0化]對(duì)于許多應(yīng)用，期望采用多重光譜可區(qū)別的巧光標(biāo)記物W便實(shí)現(xiàn)多個(gè)空間上重疊 的分析物的獨(dú)立檢測(cè)。在此類多重方法中，反應(yīng)容器的數(shù)目可W減少，運(yùn)簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)方案并 且有助于生產(chǎn)特定應(yīng)用的試劑盒。在多色自動(dòng)DNA測(cè)序中，例如，多重巧光檢測(cè)允許在單個(gè) 電泳泳道中分析多種核巧酸堿基，從而使總處理能力（throu曲put)增加超過單色方法并 且降低與泳道之間的電泳遷移率變化相關(guān)的不確定性。
[0006] 然而，多重巧光檢測(cè)可能是有問題的并且存在限制巧光標(biāo)記物的選擇的許多重要 因素。首先，難W發(fā)現(xiàn)發(fā)射光譜被適當(dāng)?shù)毓庾V分辨的染料化合物。此外，當(dāng)若干巧光染料一 起使用時(shí)，同時(shí)激發(fā)可能是困難的，因?yàn)槿玖系奈諑ǔ１粚挿旱胤珠_。許多激發(fā)方法采 用高功率激光并且因此染料必須具有足夠的光穩(wěn)定性W經(jīng)受運(yùn)樣的激光激發(fā)。分子生物學(xué) 方法中的特別重要的最終考慮是巧光染料必須與使用的試劑化學(xué)物質(zhì)諸如例如DNA合成 溶劑和試劑、緩沖液、聚合酶和連接酶相容。
[0007]隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，需要開發(fā)另外的巧光染料化合物、其核酸綴合物和滿足所有 W上限制并且特別經(jīng)得起高通量分子方法例如固相測(cè)序及類似方法的染料組。
[0008] 申請(qǐng)W02007135368描述一類適合于用作巧光標(biāo)記物的羅丹明化合物。其中描述 的化合物適合用于固相核酸測(cè)序方案中。固相核酸測(cè)序的技術(shù)和通量的發(fā)展特別地在巧光 試劑和特定的核酸序列之間的相互作用的情況下已經(jīng)導(dǎo)致對(duì)巧光標(biāo)記物的分子設(shè)計(jì)的進(jìn) 一步發(fā)展和改進(jìn)。
[0009] 具有改進(jìn)的巧光性質(zhì)（諸如，巧光強(qiáng)度、巧光最大值的位置化及巧光帶的形狀）的 巧光染料分子可W改進(jìn)核酸測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。當(dāng)在基于水的生物緩沖液中和/或在較 高溫度下進(jìn)行測(cè)量時(shí)，巧光信號(hào)強(qiáng)度尤其重要，因?yàn)榇蟛糠秩玖系那晒庠谶\(yùn)樣的條件下顯 著較低。此外，染料被附接至的堿基的性質(zhì)也影響巧光最大值、巧光強(qiáng)度和其他光譜染料性 質(zhì)。巧光染料和核堿基（nucleobase)之間的序列特異性相互作用可W通過巧光染料的特 定設(shè)計(jì)來(lái)調(diào)整。巧光染料的結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可W改進(jìn)它們的巧光性質(zhì)并且還改進(jìn)核巧酸并入的 效率、降低測(cè)序誤差的水平并且減少核酸測(cè)序中試劑的使用，并且因此降低核酸測(cè)序的成 本。
[0010] 本文描述改進(jìn)的羅丹明構(gòu)建體和其作為生物分子標(biāo)記物、特別地作為用于核酸測(cè) 序中使用的核巧酸的標(biāo)記物的用途。可W看到在此類染料（當(dāng)制備為生物分子綴合物時(shí)） 的較高巧光強(qiáng)度上W及在使用新的巧光構(gòu)建體可獲得的測(cè)序讀數(shù)的長(zhǎng)度和質(zhì)量上的改進(jìn)。
[0011] 概述
[0012] 根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供式（I)的羅丹明染料化合物及其內(nèi)消旋體：
[0013]
[0014] 本發(fā)明的內(nèi)消旋體可W包括由la、化或環(huán)形式Ic代表的式：
[0015]
[0016] 在式I、la、扣或Ic中，
[0017] M+/是常見的反離子， 陽(yáng)01引 k是從0至6的整數(shù)，
[0019] q是從1至6的整數(shù)，
[0020] Y= 0、NR。，
[0021] Ri是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
[0022] R2是Η、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基，或R2連同R1 或Rs是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0023]R3是H、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基，或R3連同R4 或Re是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0024]R4是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
[00巧]Rs和Re是Η、烷基或被取代的烷基、面素、徑基-或烷氧基，
[0026] Rs是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R1是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈，
[0027]R9是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R4是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈， 陽(yáng)0測(cè)咕是ORη或NR1化2,其中Ri郝R1迦立地是H、烷基或被取代的烷基，
[0029] Ri3是OR14或NRmRi5,其中Ri4和R15獨(dú)立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取 代的芳基，并且
[0030] Rie和R17獨(dú)立地是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
[0031] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可W與多種底物部分諸如例如核巧、核巧 酸、多核巧酸、多膚、碳水化合物、配體、顆粒和表面綴合。
[0032]因此根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了染料化合物，該染料化合物包含能夠例如 共價(jià)附接至此類底物部分的連接基。
[0033] 根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供由式：ΝΑ-染料定義的核巧或核巧酸化合物，其中Ν 是核巧酸，L是任選的連接基部分并且染料是根據(jù)本發(fā)明的巧光化合物。
[0034] 在另外的方面中，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的染料化合物測(cè)序的方法。
[0035]根據(jù)另外的方面，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的染料化合物（游離的或W綴合物形 式）的試劑盒，該試劑盒可W用于各種免疫學(xué)測(cè)定、寡核巧酸和核酸標(biāo)記W及用于通過合 成的DNA測(cè)序。在又另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含染料'組'的試劑盒，該試劑盒特別適 合于在自動(dòng)儀器平臺(tái)上進(jìn)行通過合成的測(cè)序的循環(huán)。
[0036] 本發(fā)明的另外的方面是本發(fā)明的化合物的化學(xué)制備。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1示出如本文描述的染料與現(xiàn)有技術(shù)染料相比較低的溫度降低。將染料（1-1) 和（1-3)的1.10 6Μ溶液的歸一化巧光強(qiáng)度與可商購(gòu)的染料Atto532在不同溫度下關(guān)于相 同的光譜區(qū)域進(jìn)行比較。測(cè)量染料在20°C、4(rC和60°C下的強(qiáng)度。圖1示出染料在每個(gè)溫 度下的相對(duì)強(qiáng)度。商業(yè)染料Atto532示出相對(duì)于1-1和1-3染料的在較高溫度下巧光強(qiáng)度 的較大損失。圖1證實(shí)新的染料在基于水的溶液中的巧光隨著溫度是較少可變的。
[0038] 圖2證實(shí)基于運(yùn)些新的染料的核堿基綴合物在基于水的溶液中的巧光高于可商 購(gòu)的染料（當(dāng)被532nm的光激發(fā)時(shí)）。當(dāng)ρρρΤ與可商購(gòu)的染料Atto532綴合時(shí)，將染料-核 堿基綴合物（1-13)-T和（1-11)-T的1. 106M溶液的歸一化巧光光譜與結(jié)構(gòu)類似物相比較。 在相同的核巧酸濃度下，1-3染料比atto532染料更明亮。與atto532染料相比，1-1染 料發(fā)生紅移。
[0039]圖3證實(shí)新的染料在基于水的溶液中的巧光較小地取決于溫度。將當(dāng)與核堿基綴 合時(shí)的染料T-(1-11)和T-(1-13)的1. 106M溶液的歸一化巧光強(qiáng)度與和相同的T-核堿基 綴合的可商購(gòu)的染料Atto532相比較。與atto-532相比，1-1染料和1-3染料二者在升高 的溫度下都示出較高的巧光強(qiáng)度。
[0040] 圖4證實(shí)與當(dāng)相同的核堿基與可商購(gòu)的染料Atto532(對(duì)照1)綴合時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)巧光 團(tuán)組相比，當(dāng)已用根據(jù)本發(fā)明的新染料（1-3)(泳道6)標(biāo)記核堿基時(shí)更好地區(qū)分巧光信號(hào)。 圖4示出在Illumina4顏色測(cè)序運(yùn)行中紅色強(qiáng)度相對(duì)于綠色強(qiáng)度的標(biāo)繪圖。染料信號(hào)的 組之間的較高的距離降低了誤稱（miss-call)的機(jī)會(huì)，并且因此提高測(cè)序的準(zhǔn)確度。與商 業(yè)染料相比，1-3染料的亮度的提高意指測(cè)序數(shù)據(jù)被改進(jìn)。
[0041] 詳細(xì)描述
[0042] 本發(fā)明設(shè)及新穎的羅丹明染料化合物，其特別適于巧光檢測(cè)和通過合成測(cè)序的方 法。
[0043] 根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供式（I)的羅丹明染料化合物：
[0044]
w例其中
[0046] M+/是常見的反離子，
[0047] k是從0至6的整數(shù)， W4引 q是從1至6的整數(shù)，
[0049] Ri是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
[0050] R2是Η、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基，或R2連同R1 或Rs是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0051] R3是H、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、酷胺基、徑基-或烷氧基，或R3連同R4或 Re是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0052] R4是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基， 陽(yáng)05引 Rg和Re是Η、烷基或被取代的烷基、面素、徑基-或烷氧基，
[0054]Rs是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R1是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈，
[00對(duì) R9是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R4是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈，
[0056] R,是ORη或NR1化2,其中Ri郝R1迦立地是H、烷基或被取代的烷基，
[0057] R。是OR14或NRmRi5,其中Ri4和R15獨(dú)立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取 代的芳基，并且
[0058] Rie和R17獨(dú)立地是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。
[0059] Rie和R17可W獨(dú)立地是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基。烷基可 W被S〇3取代。在Rle或R17是被so3被取代的烷基的情況下，so3基團(tuán)可W與反離子例如 金屬離子或錠離子配位。Rie和Ri7可W是H。因此，本發(fā)明的化合物包括式（II)的化合物 及其內(nèi)消旋體：
[0060]
[0061] 其中Μ+/是常見的反離子，
[0062] k是從0至6的整數(shù)，
[0063] q是從1至6的整數(shù)，
[0064] Ri是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基， 陽(yáng)〇化]R2是Η、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基，或R2連同R1 或Rs是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0066] R3是H、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基，或R3連同R4 或Re是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0067] R4是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
[0068] Rs和Re是Η、烷基或被取代的烷基、面素、徑基-或烷氧基， W例 Rs是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R1是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈，
[0070]R9是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R4是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈， 陽(yáng)071] R,是OR11或NR1化2,其中Rii和R12獨(dú)立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
[0072] Ri3是OR14或NRmRi5,其中Ri4和R15獨(dú)立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取 代的芳基。 陽(yáng)〇7引在Rie和/或R。是未被取代的烷基-畑2)占或-(CH2)mH的情況下，η和m可W是1-6。因此，本發(fā)明的化合物包括式（Ila)的化合物：
[0074]
[00巧]其中Μ是常見的反離子，
[0076] k、η和m獨(dú)立地是從0至6的整數(shù)，
[0077] q是從1至6的整數(shù)，
[0078] Ri是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基，
[0079] R2是Η、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基，或R2連同R1 或Rs是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0080] R3是H、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基，或R3連同R4 或Re是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈，
[0081] R4是Η或烷基、芳基或被取代的烷基或被取代的芳基， 陽(yáng)0間 Rs和Re是Η、烷基或被取代的烷基、面素、徑基-或烷氧基，
[0083] Rs是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R1是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈，
[0084] R9是H、面素、徑基-或烷氧基、烷基或被取代的烷基或連同R4是形成環(huán)的碳鏈或 雜取代碳鏈， 陽(yáng)0財(cái) R,是ORη或NR1化2,其中Ri郝R1迦立地是H、烷基或被取代的烷基，并且
[0086] R。是OR14或NRmRi5,其中Ri4和R15獨(dú)立地是H、烷基或被取代的烷基；芳基或被取 代的芳基。
[0087] η和m可W相同或不同。η可W是1、2、3、4、5或6。m可W是1、2、3、4、5或6。-(CH2)n-H或-(CH2)m-H可W是C1-6烷基，例如甲基、乙基或丙基，并且可W任選地被取代。 [008引q可W是1、2、3、4、5或6。除（CH2)q連接基之外，連接基可W包含在任何碳原子或 另外的雜原子處的取代基。例如，連接基可W包含W乙二醇類型的間隔基-(CH2CH2O)。-的 形式的另外的氧原子。存在連接基W使生物分子通過W酸基團(tuán)、醋基團(tuán)或酷胺基團(tuán)的形式 的C0Ri3殘基附接至負(fù)責(zé)巧光的構(gòu)建體的剩余部分并且W使生物分子從染料分子分離。
[0089]Ri可W是Η或烷基或被取代的烷基。R1可W被選擇，使得當(dāng)η是零時(shí)，R1可W不是 Η。Ri可W是甲基或乙基。Ri可W被連接至R2和/或RsW形成環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)可W是5元環(huán)或 6元環(huán)。環(huán)可W是全部碳環(huán)，或可化含有另外的雜原子。
[0090] R2可W是H、烷基或被取代的烷基、面素、簇基、甲酯胺基、徑基-或烷氧基。任選 地，R2連同Ri或Re是形成環(huán)的碳鏈或雜取代鏈。
[0091] R3可W是H、烷基或被取代的烷基、面