器可由可隨機定址的栓釘裝置、四個與栓釘裝置（96或384空格）相同格式的酶-dNTP類 似物儲槽、與栓釘裝置（96或384空格）相同格式的額外試劑儲槽（清洗、解封等）W及W 用戶可編程控制但隨機存取的方式將栓釘裝置從一個儲槽移動到另一個的輸送機構(gòu)（例 如實驗室機器人）組成。必須小屯、W避免四個酶-dNTP儲槽中的每一者受到污染，因為內(nèi) 含物在整個合成過程中會重復(fù)使用W降低每一次聚核巧酸合成的成本。
[0083]在替代實施例中，試劑（例如核巧酸類似物、酶、緩沖劑）將在固體支撐物之間移 動，從而使得回收試劑。舉例來說，具有儲槽和累的系統(tǒng)可W使四種不同核巧酸類似物溶 液、洗涂緩沖劑和/或還原劑溶液在一個或多個將形成寡核巧酸的反應(yīng)器之間移動。反應(yīng) 器和累可W為常規(guī)的，或裝置可W使用微流體構(gòu)筑。因為所述方法的非無水（水性）性質(zhì)， 所W所用硬件的設(shè)計中不需要特別小屯、地消除暴露于水。合成方法可W實施，僅采取措施 W控制蒸發(fā)損失。高度平行的實施例可W由96或384孔格式中的栓釘上的單片一系列起始 子-固體支撐物組成，其可W接合相同匹配格式的一系列孔。每一孔實際上為一通過具有 適當閥口的四個酶-dNTP類似物儲槽和額外試劑儲槽（清洗、解封等）饋料的反應(yīng)室。將 對流體學(xué)邏輯進行規(guī)定W在每一延伸反應(yīng)之后W原始方式回收酶-dNTP反應(yīng)物，運是因為 其在整個合成過程中會重復(fù)使用W降低每一次聚核巧酸合成的成本。在其它實施例中，移 液尖端的系統(tǒng)可W用W添加和去除試劑。
[0084]在合成之后，釋放的延伸產(chǎn)物可W通過高分辨率PAGE分析W確定與對照相比起 始子是否已延伸預(yù)期堿基數(shù)。還可W對一部分回收的合成DNA測序W確定合成的聚核巧酸 是否具有預(yù)期序列。
[0085]因為合成器相對簡單并且不需要亞憐酷胺合成所需的有毒組分，所W本發(fā)明的合 成器可廣泛用于研究機構(gòu)、生物技術(shù)公司和醫(yī)院。另外，能重復(fù)使用/回收試劑將減少廢棄 物產(chǎn)生并且有助于降低消耗品成本。本發(fā)明人預(yù)計所述方法和系統(tǒng)將適用于許多應(yīng)用，如 DNA測序、PCRW及合成生物學(xué)。
[0086]P又引用的方式并入
[0087]貫穿本發(fā)明已經(jīng)參考并且引用了其它文獻，例如專利、專利申請、專利公開案、期 刊、書籍、論文、網(wǎng)絡(luò)內(nèi)容。
[0088] 所有此類文檔在此出于所有目的W全文引用的方式并入本文中。
[0089] 等效內(nèi)容
[0090] 根據(jù)包含對在此引用的科學(xué)和專利文獻的參考的本文檔的完整內(nèi)容，所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員將顯而易見除本文示出和描述的之外的本發(fā)明的各種修改W及其許多其它實施 例。本文中的標的物含有重要信息、范例和指南，其可適于本發(fā)明在其各種實施例及其等效 內(nèi)容中的實踐。
【主權(quán)項】
1. 一種合成寡核苷酸的方法，其包含： 在存在核苷酸轉(zhuǎn)移酶和不存在核酸模板下使連接到固體支撐物的核酸暴露于核苷酸 類似物， 其中所述核苷酸類似物包含未經(jīng)修飾的3'羥基和可裂解封端基團，所述可裂解封端 基團封阻核苷酸轉(zhuǎn)移酶但在裂解時產(chǎn)生用于核苷酸轉(zhuǎn)移酶的核苷酸底物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸類似物包含核糖或脫氧核糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸底物包含選自由以下組成的群組的堿 基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO. 1、SEQID NO. 3或SEQIDNO. 5至少約90%-致的蛋白質(zhì)序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸轉(zhuǎn)移酶來源于具有與SEQIDNO. 2、 SEQIDNO. 4或SEQIDNO. 6至少約90% -致的核苷酸序列的生物體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可裂解封端基團抑制第二核苷酸類似物的并 入。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可裂解封端基團包含帶電部分。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述帶電部分帶負電。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可裂解封端基團包含氨基酸。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中η= 2 或 3,并且-X-為-0-、-S-、-NH-或-CH2-。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中η= 2 或 3,并且-X-為-0-、-S-、-NH-或-CH2-。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸類似物具有以下結(jié)構(gòu)：13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸類似物具有以下結(jié)構(gòu)：14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可裂解封端基團為可化學(xué)裂解、可光解裂 解、可電化學(xué)裂解或可生物裂解。15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中連接到所述固體支撐物的所述核酸在存在pH值 在約6. 5與8. 5之間的水溶液下暴露于所述核苷酸類似物。16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，連接到所述固體支撐物的所述核酸在約35°C與39°C 之間的溫度下在存在水溶液下暴露于所述核苷酸類似物。17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固體支撐物為珠粒、孔或栓釘。18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸為單鏈的。19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可裂解封端基團包含當從所述核苷酸類似 物裂解時形成環(huán)狀副產(chǎn)物的部分。20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包含： 使所述可裂解封端基團裂解以產(chǎn)生天然核苷酸；和 在存在轉(zhuǎn)移酶和不存在核酸模板下使所述天然核苷酸暴露于第二核苷酸類似物，其中 所述第二核苷酸類似物在糖環(huán)上包含3'羥基并且包含可裂解封端基團。21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包含提供包含所述核苷酸類似物和所述核 苷酸轉(zhuǎn)移酶的水溶液。22. -種用于合成寡核苷酸的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含： 固體支撐物，其結(jié)合核酸； 核苷酸轉(zhuǎn)移酶； 第一核苷酸，其包含游離3'羥基和通過可裂解連接子連接到所述核苷酸的封阻基團， 其中直到所述封阻基團經(jīng)由所述可裂解連接子去除，第二核苷酸不可以經(jīng)由所述第一 核苷酸的3'位通過所述核苷酸轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)到所述第一核苷酸，并且 其中所述系統(tǒng)不含核酸模板。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述第一核苷酸和第二核苷酸分別包含選自由 以下組成的群組的堿基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。24. -種寡核苷酸合成方法，所述方法包括以下步驟： 在不存在核酸模板的情況下提供包含多個結(jié)合核酸的固體支撐物； 使所述底物暴露于核苷酸轉(zhuǎn)移酶和具有游離3'羥基和封阻基團的核苷酸類似物，所 述封阻基團在使僅單一核苷酸類似物添加到所述多個中的至少一個成員的條件下經(jīng)由可 裂解連接子連接； 使所述可裂解連接子裂解；和 重復(fù)所述暴露步驟。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述條件包含pH值在約6. 5與8. 5之間的水溶 液。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述水溶液處于約35與39°C之間的溫度下。27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中包含游離3'羥基和經(jīng)由可裂解連接子連接的封 阻基團的所述核苷酸類似物以溶液形式提供。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其進一步包含從所述底物去除所述溶液。29. -種寡核苷酸合成方法，所述方法包括以下步驟： 使不含核酸模板的結(jié)合支撐物的核酸暴露于： 核苷酸類似物，其包含通過可裂解連接子與其連接的部分并且具有游離3'羥基，和 核苷酸轉(zhuǎn)移酶， 由此使所述核苷酸類似物并入到所述結(jié)合支撐物的核酸中； 在并入所述核苷酸類似物時清洗所述固體支撐物以去除未并入的核苷酸類似物； 使所述可裂解連接子裂解；和 重復(fù)所述暴露、清洗和裂解步驟以合成寡核苷酸。30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述核苷酸底物包含選自由以下組成的群組的 堿基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述核苷酸類似物和所述核苷酸轉(zhuǎn)移酶存在于 同一溶液中，并且所述溶液在隨后重復(fù)所述暴露、清洗和裂解步驟之間大致上得以回收。32. -種在水性環(huán)境中合成具有預(yù)定序列的寡核苷酸的設(shè)備，其包含： 與固體支撐物流體連通的第一、第二、第三和第四核苷三磷酸（NTP)試劑和酶溶液來 源，其中所述第一、第二、第三和第四來源中的所述試劑溶液選自NTP-腺嘌呤、NTP-鳥嘌 呤、NTP-胞嘧啶、NTP-胸腺嘧啶以及前述中的任一者的變體。33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中所述核苷三磷酸中的至少一部分包含未經(jīng)修飾 的3'羥基和裂解時產(chǎn)生天然核苷酸的可裂解封端基團。34. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中所述核苷酸為脫氧核苷酸。35. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其進一步包含與所述固體支撐物流體連通的洗滌儲 槽。36. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其進一步包含與固體支撐物流體連通的解封劑水溶 液來源。37. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中所述核苷三磷酸試劑流向所述固體支撐物。38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的設(shè)備，其中所述試劑溶液又從所述固體支撐物流出。39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其中所述試劑溶液在從所述固體支撐物流出之后大 致上重復(fù)使用。40. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其中將所述固體支撐物被移動到核苷三磷酸試劑/ 酶溶液的來源。41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的設(shè)備，其進一步包含經(jīng)配置以移動所述固體支撐物的可編 程操縱器。42. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其進一步包含保持所述核苷三磷酸試劑/酶來源的 孔。
【專利摘要】本發(fā)明提供改進的使用酶和特別設(shè)計的核苷酸類似物合成如DNA和RNA的聚核苷酸的方法。使用本發(fā)明方法，特異性聚核苷酸序列可以在水性環(huán)境中在不使用核酸模板下一個堿基接一個堿基地從頭合成。因為所述核苷酸類似物具有未經(jīng)修飾的3ˊOH，即如“天然”脫氧核糖和核糖分子中所見，所以所述類似物產(chǎn)生適用于并入到生物系統(tǒng)中的天然聚核苷酸。
【IPC分類】C12P19/34
【公開號】CN105264085
【申請?zhí)枴緾N201480031604
【發(fā)明人】J·W·愛夫卡維茨, S·西迪基
【申請人】分子組裝有限責任公司
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2014年4月11日