一種高效去除大型海藻表面附生微生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海藻生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高效去除大型海藻表面附生微生物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大型海藻屬于低等植物，主要包括褐藻、紅藻和綠藻。其中許多經(jīng)濟種類是人工栽培的對象，例如褐藻類的海帶(Saccharina spp.)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、羊棲菜(Sargassum fusiforme)，紅藻類的紫菜(Pyropia spp.)、紅毛菜(Bangia spp.)、江蘺(Gracilaria spp.)、石花菜(Gelidium spp.)、麒麟菜(Eucheuma spp.)，以及綠藻類的消1笞與石藥(Ulva spp.) ο
[0003]大型海藻不僅可做為健康食品(如紫菜、紅毛菜、海帶、裙帶菜、滸苔)，還可用于提取制備碘、甘露醇、藻膠等重要化工原料。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)，大型海藻還是細菌、放線菌、真菌等海洋微生物的重要宿主，其共附生微生物可以產(chǎn)生豐富的結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次級代謝產(chǎn)物，是藥物先導(dǎo)化合物的重要資源寶庫。近年來，從藻棲真菌中得到的化合物和新穎化合物分別占到海洋真菌全部化合物及新穎化合物總數(shù)的24% -27%，從藻棲細菌中也得到了如細菌素、生物酶、大環(huán)內(nèi)酯等具有特殊活性的次級代謝產(chǎn)物。利用分離純化的海藻共附生微生物進行規(guī)模發(fā)酵與提取純化，已經(jīng)成為獲得新化合物的重要手段。
[0004]海藻共附生微生物既包括存在于藻細胞表面的附生微生物，也包括存在于藻細胞內(nèi)部的內(nèi)共生微生物。高等植物共附生微生物及其次生代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，與附生微生物相比，內(nèi)共生微生物與宿主之間存在著更加高度依賴的互利關(guān)系。宿主給內(nèi)共生微生物提供營養(yǎng)，內(nèi)共生微生物則分泌植物激素刺激宿主生長，還可產(chǎn)生一些抗生性的次生代謝產(chǎn)物幫助宿主抵抗外界病菌及蟲害，其中，部分次級代謝產(chǎn)物已證實具有突出的藥用價值，例如，原產(chǎn)于紅豆杉等少數(shù)珍稀植物的高效抗腫瘤藥物紫杉醇，現(xiàn)已證實來自紅豆杉的內(nèi)生真菌。同樣，藻類相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，與藻體體表的附生微生物相比，內(nèi)共生微生物不易受到外界環(huán)境干擾，與藻類宿主的特異性更加明顯，相互作用更加密切，從中獲得獨特和新穎化合物的潛力也具顯著優(yōu)勢，因此，海藻內(nèi)共生微生物的分離純化得到了普遍關(guān)注。
[0005]為了獲得大型海藻內(nèi)共生微生物的純培養(yǎng)，必須建立一種高效清除體表附生微生物的方法?，F(xiàn)有的方法主要包括酶法、化學(xué)法和物理法等幾種解決方法。由于海藻附生微生物并非僅僅簡單地附著于細胞表面，而是通過多糖、蛋白、核酸等大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與宿主細胞建立相對緊密的聯(lián)系，因此，常規(guī)的溫和方法難以做到有效清除，會殘留大量的附生微生物。例如，玻璃珠與藻類共震蕩、超聲波處理等物理方法對內(nèi)生微生物影響較小，但是已經(jīng)有研究表明無法將附生微生物去除干凈。相反，由于海藻藻體往往比較脆弱，使用劇烈的方法又會導(dǎo)致細胞的破裂、或者內(nèi)生微生物的殺傷。例如，化學(xué)方法中的漂白粉處理能夠?qū)⒏缴⑸锶コ蓛簦菚?nèi)共生微生物產(chǎn)生嚴重影響，甚至完全殺滅。而酶法普遍需要經(jīng)過高溫的酶促處理，同樣會對內(nèi)共生微生物的多樣性組成產(chǎn)生顯著影響。
[0006]因此，為了滿足大型海藻內(nèi)共生微生物次級代謝產(chǎn)物研究與制備的要求，必須要開發(fā)一種既能將附生微生物高效徹底清除，同時對內(nèi)生微生物不具干擾的新方法，兼顧兩方面的平衡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述突出問題，本發(fā)明的目的是提供一種高效、徹底去除大型海藻表面附生微生物的方法。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0009]—種高效去除大型海藻表面附生微生物的方法，通過石英砂與待處理大型海藻共震，去除待處理大型海藻表面附生微生物。
[0010]進一步的說，研磨篩選125-250 μπι粒徑的石英砂，而后將過量的石英砂與海藻藻體混合(石英砂與海藻藻體按照質(zhì)量比為10:1—20:1)，混合后在3200rpm條件下震蕩2 X 15min，利用震蕩徹底清除海藻表面附生微生物，并保存完好的細胞。
[0011]上述震蕩結(jié)束后，將藻體與石英砂分離，無菌海水沖洗后研磨藻體并用適合培養(yǎng)基培養(yǎng)，即可獲得藻類內(nèi)共生微生物純培養(yǎng)。
[0012]進一步的是，清除附生微生物后的海藻材料用于內(nèi)共生微生物的分離；或用于無附生微生物海藻材料的獲得與培養(yǎng)；震蕩后的清洗液經(jīng)收集過濾用于附生微生物的組成分析或分離純化。
[0013]所述石英砂為普通商品化石英砂。所述大型海藻為海洋綠藻、紅藻或褐藻。所述附生與內(nèi)共生微生物為細菌、放線菌、真菌。
[0014]與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明提出了一種新思路，具有如下有益效果:
[0015]1.本發(fā)明技術(shù)不依賴任何商品化的酶制劑或生化試劑。僅以普通石英砂為原料，通過研磨并經(jīng)篩選獲得特定粒徑的石英砂，成本低廉，易于大批量制備。
[0016]2.本發(fā)明對海藻表面附生微生物的清除非常高效，一般只需通過藻體與石英砂共震蕩處理30分鐘就可以徹底清除藻類附生微生物，既要將外生菌徹底去除，又要保持細胞完好，同時，對藻類內(nèi)共生微生物幾無影響，兼顧了兩方面的要求。而現(xiàn)有方法不僅高度依賴商品化的酶和化學(xué)試劑，而且效果不理想，溫和方法不能完全清除附生微生物，而劇烈方法又對內(nèi)生微生物造成了嚴重殺傷，不能滿足要求。
[0017]3.本發(fā)明適用的海藻材料非常廣泛，不僅適用于新鮮的海藻材料(圖1，ο4)，也適用于凍存海藻材料(圖2，05)。
[0018]4.本發(fā)明可滿足多種研究需求，清除附生微生物后的海藻材料不僅可用于內(nèi)共生微生物的分離，也可用于無附生微生物海藻材料的獲得與培養(yǎng)，另外，震蕩后的清洗液還可經(jīng)收集過濾用于附生微生物的組成分析或分離純化。
【附圖說明】
[0019]圖1為掃描電鏡表征各種處理方法對海藻附生微生物的去除效果(a:鮮滸苔，未處理；b:冷凍滸苔，未處理；c:溶菌酶處理組；d:木瓜蛋白酶處理組；e:蝸牛酶處理組；f:纖維素酶處理組；g:溶菌酶+木瓜蛋白酶+蝸牛酶處理組；h:多酶清洗劑處理組；1:蛋白酶K處理組；j:酒精處理組；k:漂白粉處理組；1:UNSET buffer處理組:超聲波處理組；η:玻璃珠渦旋振蕩處理組；ol:60-120 μπι石英砂震蕩2Xlh ；o2:125-250 μm石英砂振蕩2X lh ；o3:125-250 μ m 石英砂振蕩 2X 30min ；o4:125-250 μ m 石英砂振蕩 2X 15min ；o5:o4條件應(yīng)用于凍存滸苔；p:o4條件應(yīng)用于凍存滸苔其它株系；q:o4條件應(yīng)用于鮮滸苔其它株系；r:o4條件應(yīng)用于扁滸苔；s:o4條件應(yīng)用于緣管滸苔；t:玻璃珠與125-250 μπι石英砂。自a至s，標尺為10 μm ;t中標尺為1mm)。
[0020]圖2為DGGE方法分析各處理組細菌群落結(jié)構(gòu)(m、a、k、1、1、o4:同圖1 ;u:o4組震蕩后的清洗液經(jīng)濾膜過濾后提取DNA，代表附生菌。黑色箭頭示內(nèi)共生與附生菌存在差異的條帶)。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法及該方法所達到的效果作進一步詳細說明。
[0022]本發(fā)明利用研磨和篩選得到特定粒徑范圍的石英砂，通過石英砂與海藻共震蕩來徹底去除海藻表面附生微生物。采用本發(fā)明能高效、徹底清除大型海藻表面