枯草芽孢桿菌芽孢和表面活性素同時高產(chǎn)的液體發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，是涉及一種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法，尤其是一種枯草芽孢桿菌芽孢和表面活性素同時高產(chǎn)的液體發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌(ifeciWiAS是廣泛存在于土壤環(huán)境中的一類革蘭氏陽性細(xì)菌。由于其產(chǎn)生的芽孢具有抗逆性好、易于保藏等特點，枯草芽孢桿菌能忍受極端的外部環(huán)境而長期存活，較適用于制成生物菌劑應(yīng)用于植物病害防治中?？莶菅堪麠U菌分泌的一類脂肽類化合物，由于具有抗真菌活性高、抑菌譜廣、對人畜安全的特點，正越來越受到人們的關(guān)注。其中，表面活性素是該類脂肽類化合物的典型代表，也是目前研究最多，合成機(jī)理了解最清楚的一類脂肽類抑菌化合物。目前，以表面活性素為主要抑菌成分的枯草芽孢桿菌生物殺菌劑已經(jīng)實現(xiàn)商品化生產(chǎn)，在農(nóng)業(yè)病害防治中得到大量應(yīng)用。隨著該類微生物殺菌劑的應(yīng)用，提高枯草芽孢桿菌芽孢和表面活性素產(chǎn)量的研究也將越來越受到重視。
[0003]微生物菌劑絕大部分產(chǎn)品都是以活菌加以作用的，有效的活菌數(shù)是衡量微生物菌劑品質(zhì)的重要指標(biāo)。產(chǎn)品中必須含有相當(dāng)數(shù)量的活菌數(shù)才能達(dá)到作用的效果。我國對各種正式批準(zhǔn)生產(chǎn)的菌劑都有明確的有效活菌數(shù)量和用量的規(guī)定。但是微生菌劑隨著保存時間的延長，活菌數(shù)量不斷減少。
[0004]芽孢是枯草芽孢桿菌在一定條件下形成的應(yīng)對不良環(huán)境的休眠體，其本身對高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強(qiáng)的抗性。當(dāng)條件轉(zhuǎn)好時，芽孢又可以形成正常活菌細(xì)胞。目前，幾乎所有的枯草芽孢桿菌微生物殺菌劑均選用芽孢作為劑型成分以便于運(yùn)輸和長期貯存。芽孢和表面活性素是枯草芽孢桿菌類微生物殺菌劑劑型及防治效果的關(guān)鍵特性。因此，理想的枯草芽孢桿菌微生物殺菌劑應(yīng)該滿足芽孢和表面活性素的同時高產(chǎn)。然而，在實際生產(chǎn)中表面活性素和芽孢很難實現(xiàn)同時高產(chǎn)?？莶菅挎邨U菌形成芽孢之后就不再分泌表面活性素，由于芽孢形成導(dǎo)致表面活性素分泌時間過短成為限制表面活性素產(chǎn)量的一個重要因素。因此，如何實現(xiàn)枯草芽孢桿菌表面活性素產(chǎn)量和芽孢形成率的同時高產(chǎn)是目前亟待解決的一個難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種枯草芽孢桿菌芽孢和表面活性素同時高產(chǎn)的液體發(fā)酵方法。芽孢和表面活性素是枯草芽孢桿菌類微生物殺菌劑劑型及防治效果的關(guān)鍵特性。同時提高芽孢形成率和表面活性素產(chǎn)量對于提高枯草芽孢桿菌類微生物殺菌劑的應(yīng)用推廣具有顯著的推動作用。
[0006]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌芽孢和表面活性素同時高產(chǎn)的液體發(fā)酵方法技術(shù)方案為，包括以下步驟:
(O種子培養(yǎng):
將枯草芽孢桿菌接種到液體種子培養(yǎng)基中，32?40°c條件下，搖床培養(yǎng)10?16 h得到種子液；
(2)前期表面活性素合成階段:
以3%?8%的接種量將步驟(I)培養(yǎng)得到的種子液接種到發(fā)酵容器的發(fā)酵培養(yǎng)基中，36?40°C條件下，搖床培養(yǎng)2?3 h ;待發(fā)酵液OD6。。達(dá)到1.0時，將溫度調(diào)至31?35°C，搖床繼續(xù)培養(yǎng)32?48 h得到發(fā)酵液；
(3)后期芽孢形成階段:
向發(fā)酵液中加入終濃度為0.3?0.5 g/L的MnCl2溶液，然后將發(fā)酵容器快速置于冰水浴中處理10?15 min，取出發(fā)酵容器繼續(xù)36?40°C條件下培養(yǎng)30?120 min分鐘，收集菌體及發(fā)酵液。
[0007]步驟(I)中的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC 10366，拉丁文名稱為Bacillus sub tills subsp.sub tills,該菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 10366。
[0008]步驟(I)中的液體種子培養(yǎng)基為，酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸餾水至 1000 mL。
[0009]步驟(I)中，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120?220 r/min。
[0010]步驟(2)中36?40°C條件下，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120?220 r/min。
[0011]步驟(2)中將溫度調(diào)至31?35°C，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120?220 r/min。
[0012]步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基為，葡萄糖20 g，MgSO4.7Η20 0.5 g，L-谷氨酸5 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，加蒸餾水至 1000 mL。
[0013]所述的枯草芽孢桿菌芽孢和表面活性素同時高產(chǎn)的液體發(fā)酵方法，具體為:
發(fā)酵菌株:枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC 10366 ；
種子培養(yǎng)基:酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸饋水至1000 mL ；
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 20 g, MgSO4.7Η20 0.5 g，L_谷氨酸 5 g，KCl 0.5 g, KH2PO4 0.5g，加蒸餾水至1000 mL ；
生產(chǎn)過程:
Cl)種子培養(yǎng):
從生長枯草芽孢桿菌平皿上挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，37°C條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)12 h得到種子液；
(2)前期表面活性素合成階段:
以3%?8%的接種量將步驟(I)培養(yǎng)得到的種子液接種到發(fā)酵容器中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)3 h ;待發(fā)酵液OD6。。達(dá)到1.0左右時，將溫度調(diào)至33°C，180 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)40 h得到發(fā)酵液；
(3)后期芽孢形成階段:
向發(fā)酵液中加入終濃度為0.4 g/L的MnCl2溶液，然后將發(fā)酵容器快速置于冰水浴中處理12 min，取出發(fā)酵容器繼續(xù)37°C條件下培養(yǎng)60 min分鐘，收集菌體及發(fā)酵液。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明利用發(fā)酵條件控制枯草芽孢桿菌在發(fā)酵前期不產(chǎn)生芽孢，從而大量形成表面活性素；到發(fā)酵后期通過加入MnCljP冰水浴誘使芽孢短時間內(nèi)大量形成。這有效解決了一直以來存在的芽孢和表面活性素不能同時高產(chǎn)的矛盾，對于提高枯草芽孢桿菌類微生物殺菌劑的應(yīng)用推廣具有顯著的推動作用。
[0015]【具體實施方式】:
為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。
[0016]實施例1
發(fā)酵菌株:枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC 10366
種子培養(yǎng)基:酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸饋水至1000 mL。
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，MgSO4WH2O 0.5g，L_谷氨酸 5 g，KCl 0.5 g，KH2PO40.5 g，加蒸饋水至1000 mL。
[0018]生產(chǎn)過程:
O種子培養(yǎng):
從生長枯草芽孢桿菌平皿上挑取單菌落接種到裝液量為50mL種子培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，32°C條件下，120 r/min搖床培養(yǎng)10 h得到種子液；
2)前期表面活性素合成階段:
以3%?8%的接種量將種子液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為200 mL的1000 mL三角瓶中，36°C條件下，120 r/min搖床培養(yǎng)2 h ;待發(fā)酵液0D_達(dá)到1.0左右時，將溫度調(diào)至31°C，120 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)32 h得到發(fā)酵液；
3)后期芽孢形成階段:
向發(fā)酵液中加入終濃度為0.3 g/L的MnCl2溶液，然后將發(fā)酵三角瓶快速置于冰水浴中處理10 min，取出三角瓶繼續(xù)36°C條件下培養(yǎng)30 min分鐘，收集菌體及發(fā)酵液，檢測芽孢形成率和表面活性素產(chǎn)量。
[0019]結(jié)果:經(jīng)檢測，最終發(fā)酵液中表面活性素產(chǎn)量可達(dá)到653.55 mg/L，芽孢形成率可達(dá)到91.2%ο
[0020]實施例2
發(fā)酵菌株:枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC 10366
種子培養(yǎng)基:酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸饋水至1000 mL。
[0021]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，MgSO4WH2O 0.5g，L_