擴(kuò)大間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)的方法、組合物及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開涉及處理間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞以獲得有活力和有潛能的干細(xì)胞組合物的方法。特 別地，本公開涉及用于獲得高細(xì)胞產(chǎn)率的一致性、增加的活力、低HLA-DR和潛能的用于臨 床和治療應(yīng)用的間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法。進(jìn)一步地，本公開還涉及首尾相接（end-to-end)的 生產(chǎn)方法以及在針對(duì)所述應(yīng)用給藥之前或過(guò)程中減少最終組合物的操作。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（hMSC)作為較小群體的細(xì)胞存在于骨髓中（占0.001 %至 〇. 01%的有核細(xì)胞），但在培養(yǎng)中它們可以快速生長(zhǎng)并且擴(kuò)增而不損失它們的干細(xì)胞特性 (sternness)。具有它們的以下屬性的hMSC具有在許多受損組織中增強(qiáng)修復(fù)的潛能：（1)容 易分離、（2)高擴(kuò)增潛能、（3)遺傳穩(wěn)定性、（4)可重復(fù)特性以及（5)與組織工程原理的相容 性。
[0003] 現(xiàn)在，MSC和MSC類細(xì)胞已經(jīng)從除了骨髓包括脂肪組織、羊水、骨膜（periostium) 和胎兒組織的各種組織中分離，并且示出了表型異質(zhì)性。已經(jīng)廣泛研究了獲得自人類來(lái)源 如骨髓（hBMSC)的間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，這是因?yàn)樗鼈兊南鄬?duì)容易獲得以及分化成骨形成、脂形 成和軟骨形成譜系，以及其他種類的組織或細(xì)胞（包括肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元）的分化 潛能。它們的多種分化潛能和自我更新已經(jīng)增加了對(duì)于該干細(xì)胞作為具有在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用 中的自我更新的細(xì)胞來(lái)源的關(guān)注。此外，它們基于對(duì)于培養(yǎng)基質(zhì)粘附的分離構(gòu)成用于消除 非間質(zhì)譜系的簡(jiǎn)單策略，降低對(duì)于依賴特定表面標(biāo)記物的表達(dá)的復(fù)雜的細(xì)胞分離方法的依 賴性。
[0004] 進(jìn)一步地，通常使用平面技術(shù)（燒瓶）生產(chǎn)用于治療應(yīng)用的粘附的間質(zhì)干細(xì)胞。十 層堆疊（stack)或容器已經(jīng)用于促進(jìn)幾種異源細(xì)胞治療產(chǎn)品進(jìn)入早期、中期至后期臨床開 發(fā)。擴(kuò)大來(lái)自實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的基于傳統(tǒng)燒瓶的培養(yǎng)過(guò)程通常涉及商業(yè)可獲得的堆疊-板系統(tǒng) 如科寧細(xì)胞堆疊（CorningCellSTACKS)。這些多層容器已經(jīng)用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。傳統(tǒng) 的10層細(xì)胞堆疊已經(jīng)用于制造加工并且正在用作用于治療應(yīng)用的異源間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的良 好生產(chǎn)規(guī)范（GMP)生產(chǎn)的平臺(tái)。
[0005] 盡管，使用間質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞的細(xì)胞治療示出了巨大希望，骨髓衍生的MSC的限制 是它們的較小數(shù)量，然而對(duì)于臨床應(yīng)用，需要大量的MSC。隨著間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC)的研究 轉(zhuǎn)換為商業(yè)產(chǎn)品，將細(xì)胞類產(chǎn)品帶入市場(chǎng)的另一個(gè)主要阻礙是對(duì)于穩(wěn)健并且可重復(fù)的生產(chǎn) 過(guò)程以及用于生物系統(tǒng)的冷凍保存介質(zhì)和儲(chǔ)存容器的質(zhì)量的需要。
[0006] MSC是多潛能的并且能夠分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。已經(jīng)更廣泛地使 用BM衍生的MSC并且存在更大量的與它們的臨床安全性和實(shí)踐有關(guān)的數(shù)據(jù)。為了滿足臨 床需求，需要快速并且穩(wěn)健的MSC擴(kuò)增方法用于均勻、現(xiàn)成產(chǎn)品的制造和大規(guī)模庫(kù)存的儲(chǔ) 存。在現(xiàn)有技術(shù)中，PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2009/053891公開了包含具有降低的免疫原性的間質(zhì) 干細(xì)胞的藥用組合物以及使用離心過(guò)濾制造其的方法。該專利申請(qǐng)是關(guān)于利用離心過(guò)濾制 造一種或多種純化的MSC藥用組合物的方法，但沒有公開細(xì)胞類產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)如細(xì) 胞產(chǎn)率和HLA-DR。進(jìn)一步地，純化的MSC組合物包含小于55ug/ml的殘留BSA。然而，這沒 有提供實(shí)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)率、活力和質(zhì)量參數(shù)如低HLA-DR和純度的增加的見解。美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?13/267, 363提供了具有重要治療潛能、具有培養(yǎng)中穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和功能表型的間質(zhì)干細(xì)胞的 制備，擴(kuò)增MSC以生產(chǎn)臨床規(guī)模的治療制劑的方法及其醫(yī)療用途。另一個(gè)PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/ US2011/022054集中于用于制造細(xì)胞治療產(chǎn)品以及使用TFF(該技術(shù)用于降低隨后過(guò)程中 的BSA含量），通過(guò)體積減小洗滌細(xì)胞治療產(chǎn)品的方法和裝置。然而，在TFF過(guò)程中，沒有提 供關(guān)于細(xì)胞損失的數(shù)據(jù)，并且此外，BSA水平在約100ng/ml的范圍內(nèi)，這被認(rèn)為不適合用于 治療應(yīng)用。因此，對(duì)于將確保生長(zhǎng)因子（bFGF)對(duì)于用于均勻細(xì)胞分布和增殖的培養(yǎng)基的均 勻分布的方法，用于改善細(xì)胞產(chǎn)率、活力、一致性、減少的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間和細(xì)胞損失、沒有雜 質(zhì)的方法以及保存細(xì)胞產(chǎn)品以改善其保質(zhì)期的方法，仍然存在需要。
[0007] 傳統(tǒng)遵循的干細(xì)胞擴(kuò)增和細(xì)胞類產(chǎn)品的最終遞送的方法中看出的主要阻礙是：
[0008] ?缺乏短持續(xù)時(shí)間內(nèi)獲得較大細(xì)胞產(chǎn)率的一致生產(chǎn)；
[0009] ?洗滌和離心過(guò)程期間的高細(xì)胞損失，導(dǎo)致低細(xì)胞產(chǎn)率和活力；
[0010] ?昂貴的儲(chǔ)存和運(yùn)輸；
[0011] ?在給予患者之前，要求一定量的冷凍保存的細(xì)胞的重新構(gòu)成（復(fù)原， reconstitution);以及
[0012] ?在醫(yī)院進(jìn)一步操作冷凍保存的細(xì)胞，由此使得產(chǎn)品易受細(xì)胞損失或無(wú)菌度損失。
[0013] 因此，本公開提供了用于克服以上問(wèn)題的方法和裝置。因此，本公開嘗試克服對(duì)于 綜合生產(chǎn)過(guò)程以及最終產(chǎn)品的儲(chǔ)存的開發(fā)的增加需要。因此，致力于方法改善和用于開發(fā) 即可使用的用于細(xì)胞治療的異源間質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞的策略，當(dāng)今，異源間質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞是 細(xì)胞治療中最廣泛使用的細(xì)胞類型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本公開涉及用于培養(yǎng)間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括以下動(dòng)作：在包括堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)的培養(yǎng)基存在下，允許培養(yǎng)直至第一預(yù)定傳代的間質(zhì)基質(zhì)細(xì) 胞擴(kuò)增至第二預(yù)定傳代，其中，當(dāng)所述細(xì)胞實(shí)現(xiàn)至少一個(gè)預(yù)定匯合時(shí)，通過(guò)使細(xì)胞與所述培 養(yǎng)基接觸進(jìn)行所述擴(kuò)增；并且其中，當(dāng)與第一預(yù)定傳代的細(xì)胞數(shù)目相比時(shí)，所述方法使第二 預(yù)定傳代結(jié)束時(shí)的細(xì)胞數(shù)目增加了 2000倍。
[0015] 本公開還涉及對(duì)于配制用于臨床或治療應(yīng)用的預(yù)定劑量將BSA的量減少至低于 50ng/ml的水平的方法，所述劑量包括通過(guò)培養(yǎng)所述細(xì)胞獲得的間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，所述方法包 括將組合物進(jìn)行離心和用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌的組合以減少所述BSA的量的動(dòng)作。
[0016] 本公開還涉及用于儲(chǔ)存間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：在范圍從 每ml的冷凍混合物約5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞至約0. 25億個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度下，使細(xì)胞經(jīng)受冷凍混 合物，以及在范圍從約-75°C至約_85°C的溫度下或在范圍從約_190°C至約_200°C的溫度 下儲(chǔ)存細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 為了可以容易地理解本公開并且付諸實(shí)踐，現(xiàn)在將參考如參照附圖示出的示例性 實(shí)施方式。根據(jù)本公開，附圖連同以下詳細(xì)描述并入說(shuō)明書中并且形成說(shuō)明書的一部分，并 且用于進(jìn)一步示出實(shí)施方式并且說(shuō)明各種原理和優(yōu)點(diǎn)，其中：
[0018] 圖1中的A:示出了傳代4次（P4)每批次的間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)率。
[0019] 圖1中的B:示出了來(lái)自圖1中的A的5個(gè)單獨(dú)批次的平均細(xì)胞產(chǎn)率。
[0020] 圖2 :示出了P5下來(lái)自不同批次的總細(xì)胞產(chǎn)率。
[0021] 圖3A:示出了來(lái)自本公開的不同批次的P5收獲的7AAD的活力百分?jǐn)?shù)的圖形表 不。
[0022] 圖3B:示出了本公開的解凍后頂P的7AAD的活力百分?jǐn)?shù)的圖形表示，顯示解凍后 的活力的顯著的一致性。
[0023] 圖3C:示出了圖3B的5個(gè)單獨(dú)生產(chǎn)批次的解凍后頂P的7AAD的活力百分?jǐn)?shù)的平 均值。
[0024] 圖4A:示出了本方法的不同生產(chǎn)批次中收獲后HLA-DR表達(dá)的表示，其示出了 HLA-DR的顯著較低的表達(dá)。
[0025] 圖4B:示出了圖4A的5個(gè)單獨(dú)生產(chǎn)批次的收獲后HLA-DR表達(dá)的平均值。
[0026] 圖4C:示出了使用本公開的方法的不同生產(chǎn)批次中的解凍后HLA-DR表達(dá)的表示。
[0027] 圖4D:示出了圖4C的5個(gè)單獨(dú)生產(chǎn)批次的解凍后HLA-DR表達(dá)的平均值。
[0028] 圖5A:示出了bFGF母液混合物（mastermix)的制備。
[0029] 圖5B:示出了種子母液混合物（seedmastermix)的制備。
[0030] 圖6A:示出了實(shí)施bFGF和種子母液混合物之前（'先前已知的'）和之后（本公 開的'新方法'）在不同生產(chǎn)批次中細(xì)胞產(chǎn)率的一致性。
[0031] 圖6B:示出了實(shí)施bFGF和種子母液混合物之前（'先前已知的'）和之后（本公 開的'新方法'）在不同生產(chǎn)批次中HLA-DR表達(dá)的一致性。
[0032] 圖7A⑴和圖7A(2):示出了與其中根據(jù)天數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)的之前已知的方法（1) 相比，基于匯合的進(jìn)料時(shí)間表對(duì)基于匯合的本方法的不同批次的單獨(dú)10細(xì)胞堆疊（Cell STACK)的細(xì)胞產(chǎn)率的影響（2)。
[0033] 圖7B⑴和圖7B⑵：示出了與其中根據(jù)天數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)的之前已知的方法⑴相 比，基于匯合的本方法的不同生產(chǎn)批次的單獨(dú)10細(xì)胞堆疊中HLA-DR表達(dá)（2)。
[0034] 圖8A:示出了按照本公開中指出的洗滌步驟（即，用200ml的DPBS進(jìn)行洗滌I并 且用90ml的DPBS進(jìn)行洗滌ΙΙΠΜΡ中的BSA水平相對(duì)于按照先前已知的洗滌步驟（即，各 自用200ml的DPBS進(jìn)行洗滌I和洗滌II)獲得的頂P中的BSA水平的比較。
[0035] 圖8B:示出了如按照本公開中指出的洗滌步驟（即，用200ml的DPBS進(jìn)行洗滌I 并且用90ml的DPBS進(jìn)行洗滌II)獲得的本公開的最終產(chǎn)品中的細(xì)胞損失相對(duì)于按照先前 已知的洗滌步驟（即，各自用200ml的DPBS進(jìn)行洗滌I和洗滌II)獲得的最終產(chǎn)品的細(xì)胞 產(chǎn)率的比較。
[0036] 圖8C:示出了當(dāng)與先前已知的洗滌方法比較時(shí)，洗滌和離心對(duì)于來(lái)自本方法的最 終產(chǎn)品的解凍后的細(xì)胞恢復(fù)的影響。
[0037] 圖9A:示出了遵循用CS5冷凍保存的BM-MSC的7AAD的解凍后的活力，在每mlCS5 存在5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞、0. 1億個(gè)細(xì)胞、0. 125億個(gè)細(xì)胞、0. 15億個(gè)細(xì)胞和0. 25億個(gè)細(xì)胞的五個(gè) 不同的冷凍濃度下，在一周、一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月和六個(gè)月的冷凍保存期（時(shí)間點(diǎn)）下， 評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。
[0038] 圖9B:示出了遵循用CS5冷凍保存的BM-MSC的解凍后的總細(xì)胞恢復(fù)（Totalcell recovery) (TCR)。在一周、一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月和六個(gè)月的冷凍保存期（時(shí)間點(diǎn)）下，通 過(guò)用錐蟲藍(lán)染色細(xì)胞評(píng)價(jià)TCR。全部活力和無(wú)活力的總和計(jì)為TCR。觀察到了每mlCS5存 在5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞、0. 1億個(gè)細(xì)胞、0. 125億個(gè)細(xì)胞、0. 15億個(gè)細(xì)胞和0. 25億個(gè)細(xì)胞的五個(gè)不 同的冷凍濃度的TCR。
[0039] 圖10A:示出了 25M劑量、50M劑量和75M劑量的不同劑量的每mlCS5冷凍混合物 25M細(xì)胞的7AAD在-196°C下儲(chǔ)存6個(gè)月的活力。
[0040] 圖10B:示出了 25M劑量、50M劑量和75M劑量的不同劑量的每mlCS5冷凍混合物 25M細(xì)胞在-196 °C下儲(chǔ)存6個(gè)月的細(xì)胞恢復(fù)。
[0041] 圖10C:示出了 1億和2億的不同劑量的每mlCS5冷凍混合物25M細(xì)胞的7AAD 在-196°C下儲(chǔ)存12個(gè)月的活力。Y軸表示7AAD的活力％。
[0042] 圖11A:通過(guò)抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)的能力示出了頂P的免疫抑制性能。數(shù) 據(jù)是六個(gè)單獨(dú)批次的平均值。
[0043] 圖11B:示出了來(lái)自頂P-MLR共培養(yǎng)物的上清液中的PGE-2的評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)是五個(gè) 單獨(dú)批次的平均值。
[0044] 圖11C:示出了生產(chǎn)的PGE-2的量和頂P的免疫抑制能力之間的相互關(guān)系。
[0045] 圖12 :示出了當(dāng)與通過(guò)先前已知的方法生產(chǎn)的細(xì)胞類產(chǎn)品相比時(shí)，在生產(chǎn)VEGF方 面頂P的血管生成潛能。
[0046] 圖13 :示出了當(dāng)與通過(guò)先前已知的方法生產(chǎn)的細(xì)胞類產(chǎn)品相比時(shí)，在生產(chǎn)sGAG方 面IMP的軟骨細(xì)胞潛能。
[0047] 圖14A:示出了直接穩(wěn)定性和加速穩(wěn)定性研究的第3個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的7AAD的解凍后 活力。
[0048] 圖14B:示出了 -80°C直接（右邊）和加速穩(wěn)定性（左邊）研究3個(gè)月的解凍后增 殖。
[0049] 圖14C:示出了 -80°C直接和加速（對(duì)照）穩(wěn)定性研究的解凍后CFU-F。
[0050] 圖14D:示出了 -80°C直接和加速穩(wěn)定性研究的三譜系分化。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 本公開涉及用于培養(yǎng)間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（mesenchymalstromalcell)的方法，所述方 法包括以下動(dòng)作：
[0052]a.在包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)的培養(yǎng)基的存在下，允許培養(yǎng)直至第 一預(yù)定傳代的間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增至第二預(yù)定傳代；
[0053] 其中，當(dāng)所述細(xì)胞實(shí)現(xiàn)至少一個(gè)預(yù)定匯合時(shí)，通過(guò)使細(xì)胞與所述培養(yǎng)基接觸進(jìn)行 所述擴(kuò)增；并且其中，當(dāng)與所述第一預(yù)定傳代的細(xì)胞數(shù)目相比時(shí)，所述方法使第二預(yù)定傳代 結(jié)束時(shí)的細(xì)胞數(shù)目增加了 2000倍。
[0054] 在本公開的一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞數(shù)目的增加發(fā)生在21天的最大期間中。
[0055] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)連續(xù)傳代，允許第一預(yù)定傳代的細(xì)胞擴(kuò)增至 第二預(yù)定傳代；并且其中，第一預(yù)定傳代范圍從傳代2次至傳代9次；并且，第二預(yù)定傳代 范圍從傳代5次至傳代10次。
[0056] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，第一預(yù)定傳代是傳代3次；并且，第二預(yù)定傳代是 傳代5次。
[0057] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，用于所述擴(kuò)增的接種的細(xì)胞的數(shù)目范圍從約60 萬(wàn)至約70萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；并且，在所述擴(kuò)增之后獲得的細(xì)胞的數(shù)目是至少約18億個(gè)細(xì)胞；并且 其中，所述方法使細(xì)胞數(shù)目增加了至少2000倍。
[0058] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的組分是濃度范圍從約75 %至95%的 Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基-KnockOut[DMEM-K0]、濃度范圍從約5 %至15 %的胎牛血清 [卩85]、濃度范圍從約0.5%至2%的谷氨酰胺、具有約501]/1111至約1001]/1111的濃度的青霉 素和約50μg/ml至約100μg/ml的濃度的鏈霉素的青鏈霉素、以及濃度范圍從約0. 5ng/ml 至5ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)。
[0059] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，以避免體積誤差并且提供bFGF在培養(yǎng)基的多個(gè) 等分部分中均勻分布的方式，通過(guò)母液混合組分的方法制備培養(yǎng)基，所述方法包括以下動(dòng) 作：
[0060] a.制備'X'升包括DMEM-K0、FBS、谷氨酰胺和青鏈霉素，缺乏bFGF的培養(yǎng)基，以及 分配在'X'個(gè)lLtr容器中并且將容器從1至'X'標(biāo)記；
[0061] b.從容器1號(hào)取出'Z'ml的培養(yǎng)基，并且分配在標(biāo)記號(hào)為'Χ+Γ的新無(wú)菌容器 中；
[0062] c.將預(yù)定量的bFGF添加至'X減㈠Z'ml的容器1號(hào)的培養(yǎng)基，并且充分地混合 以獲得bFGF母液混合物；
[0063] d.從標(biāo)記為2至'X'的容器的每個(gè)中單獨(dú)取出等量的培養(yǎng)基，并且在容器'Χ+Γ 號(hào)中添加'Z'ml的培養(yǎng)基，從而使得容器'Χ+Γ號(hào)的總培養(yǎng)基體積為'B'ml;以及
[0064] e.單獨(dú)取出第二預(yù)定量的在步驟（c)中獲得的bFGF母液混合物，并且在容器2至 'X'中各自添加'B'ml培養(yǎng)基，從而使得每個(gè)所述容器中的體積相等，并且制備培養(yǎng)基的多 個(gè)等分部分。
[0065] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，至少一個(gè)預(yù)定匯合選自包括約30%至約40%、約 40 %至約50%、以及約60 %至約70%、或它們的任何組合的匯合范圍。
[0066] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)使細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸的擴(kuò)增包括以下動(dòng)作：
[0067] a.通過(guò)以范圍從約1000個(gè)細(xì)胞/cm2至約7000個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種細(xì)胞 并且將培養(yǎng)基提供給接種的細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增成連續(xù)傳代；以及
[0068] b.允許細(xì)胞達(dá)到約40%至約50%的預(yù)定匯合，并且更換培養(yǎng)基以獲得擴(kuò)增的細(xì) 胞；
[0069] 其中，整個(gè)擴(kuò)增中使用的培養(yǎng)基濃度范圍從約0. 15ml/cm2至約0. 35ml/cm2。
[0070] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò)增使細(xì)胞數(shù)目增加了至少30倍。
[0071] 在本公開的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)使細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸的擴(kuò)增包括以下動(dòng)作：
[0072] a.通過(guò)以范圍從約1000個(gè)細(xì)胞/cm2至約7000個(gè)細(xì)胞/cm2的接種密度接種細(xì)胞 并且將培養(yǎng)基提供給接種的細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增成連續(xù)傳代；
[0073] b.