一種雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法，特別涉及一種大規(guī)模純化雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽廣泛存在于動植物和微生物中，是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物體內(nèi)大量存在并起主要作用的是GSH，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內(nèi)分泌疾病，并作為生物活性添加劑及抗氧化劑用于食品領(lǐng)域。
[0003]GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)經(jīng)肽鍵縮合而成的三肽。相對分子質(zhì)量為307.32，等電點為5.93，常溫下為白色晶體，易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。
[0004]經(jīng)典的酶法生產(chǎn)GSH依賴于γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh I)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II)兩種酶，Gsh I催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸合成γ -谷氨酰半胱氨酸，Gsh II催化γ_谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。在GSH合成過程中，由于Gsh I催化過程受到終產(chǎn)物GSH的反饋抑制，因此使生成γ -谷氨酰半胱氨酸的第一步反應(yīng)成為整個GSH合成的限速步驟。
[0005]隨著進(jìn)一步研究，人們在單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等十幾種細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)了一種雙功能谷胱甘肽合成酶(GshF)。該酶同時具有Gsh I與Gsh II的活性，可一步催化GSH合成，且該酶反饋抑制作用較小，非常適和應(yīng)用于酶法合成谷胱甘肽。
[0006]利用雙功能谷胱甘肽合成酶(GshF)高效率合成GSH，首先需要得到純度較高的GshF ο為了得到較高純化的酶，一般需要用到離子交換層析、凝膠層析等方法，而此類方法耗時長，成本高并且酶的回收率低，不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)GshF。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法，其克服了現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0009]—種雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法，包括以下步驟:
[0010](1)制備含雙功能谷胱甘肽合成酶的粗提液。
[0011](2)向粗提液中加入濃度為0.001M-0.5M(優(yōu)選的為0.005M-0.2M)的二價金屬離子，去除沉淀(該沉淀主要為雜蛋白)，得上清液。
[0012](3)將上清液的pH值調(diào)節(jié)至4-9，再加入濃度為0.005M-0.4M (優(yōu)選的為0.005M-0.2M)的二價金屬離子銅離子(Cu2+)、錳離子(Mn2+)或鋅離子(Zn2+)的一種或幾種，收集沉淀，該沉淀即為雙功能谷胱甘肽合成酶。
[0013]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，粗提液的制備方法為:將含雙功能谷胱甘肽合成酶的菌體溶于水中進(jìn)行破碎處理，破碎后進(jìn)行初沉淀，去除沉淀，得到含雙功能谷胱甘肽合成酶的粗提液。初沉淀過程中可去除大量細(xì)胞碎片及雜蛋白。
[0014]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，初沉淀的方法為酸堿沉淀或飽和度2-30 %硫酸銨沉淀。
[0015]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，酸堿沉淀的方法為先將粗酶液的pH值調(diào)至7-9后，再調(diào)節(jié)pH值至3-7，去除沉淀；或先將粗酶液的pH值調(diào)至3-7后，再調(diào)節(jié)pH值至7_9，去除沉淀。
[0016]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述酸選自于鹽酸、磷酸、硫酸或醋酸的一種或幾種，所述堿選自于氫氧化鉀、氫氧化鈉、氨水、Tris或三乙醇胺的一種或幾種。
[0017]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟(1)的破碎處理為高壓均質(zhì)破碎、酶解破碎、冷凍破碎或超聲破碎。
[0018]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟⑵中的二價金屬離子選自于鈣離子(Ca2+)、鎂離子(Mg2+)、鐵離子(Fe2+)、鈷離子(Co2+)、鎘離子(Cd2+)或鎳離子(Ni2+)的一種或幾種。
[0019]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟(2)和步驟(3)中的二價金屬離子均選自于可溶性鹽或可溶性鹽的水合物中的一種或幾種。
[0020]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，可溶性鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、硝酸鹽或氯化鹽。
[0021]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟⑴至步驟(3)的操作溫度為4°C -40°C。
[0022]本發(fā)明上述技術(shù)方案，具有如下有益效果:
[0023]本發(fā)明的雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法，與傳統(tǒng)的使用超濾、離子交換層析、凝膠篩層析等方法提純同樣量的蛋白相比，其更加簡單，易于操作，耗時短、成本低，且該方法制備的GshF不溶于水，可重復(fù)使用，更加適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)GshF。
【附圖說明】
[0024]圖1為根據(jù)本發(fā)明的一種雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法的各步驟流程圖。
[0025]圖2為根據(jù)本發(fā)明的一種雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法的各步驟電泳圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行詳細(xì)描述，以便于進(jìn)一步理解本發(fā)明。
[0027]本發(fā)明的雙功能谷胱甘肽合成酶的純化方法請參見圖1的各步驟流程圖。其純化結(jié)果可參見圖2的各步驟電泳圖。
[0028]實施例1
[0029](1)取含有GshF酶的菌體溶于水中，菌體濃度約為100g/L，高壓均質(zhì)破碎。
[0030](2)使用鹽酸調(diào)節(jié)破碎后酶液的pH值至5.0，25°C放置30分鐘后，再使用氫氧化鈉將酶液pH值調(diào)至7.0，離心去除沉淀。
[0031](3)在酶液中加入0.05M氯化鈣，4-10°C放置30分鐘后，離心除去沉淀雜質(zhì)；
[0032](4)最后調(diào)節(jié)pH值至6.0，再加入0.02M氯化銅、0.01M氯化錳及0.02M硫酸鋅，4-10°C放置30分鐘后，離心收集沉淀，即為GshF酶。
[0033]將少量純化后的固體GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用現(xiàn)有技術(shù)記載的公知的測定GshF酶活性的方法，檢測到GshF酶活性約為300U，其中將1 μ Μ底物在1分鐘內(nèi)完全轉(zhuǎn)化定義為1個活性單位(U)。
[0034]實施例2
[0035](1)取含有GshF酶的菌體溶于水中，菌體濃度約為100g/L，高壓均質(zhì)破碎。
[0036](2)使用鹽酸調(diào)節(jié)破碎后酶液的pH值至3.0，4°C放置30分鐘后，再使用氫氧化鈉將酶液pH值調(diào)至7.0，離心去除沉淀。
[0037](3)在酶液中加入0.001M氯化鈣及0.001M氯化亞鐵，4°C放置30分鐘后，離心除去沉淀雜質(zhì)；
[0038](4)最后調(diào)節(jié)pH值至4.0，再加入0.005M氯化銅、0.005M氯化錳及0.4M硫酸鋅，4°C放置30分鐘后，離心收集沉淀，即為GshF酶。
[0039]將少量固體GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用現(xiàn)有技術(shù)記載的公知的測定GshF酶活性的方法，檢測到GshF酶活性約為80U，其中將1 μ Μ底物在1分鐘內(nèi)完全轉(zhuǎn)化定義為1個活性單位(U)。
[0040]實施例3
[0041](1)取含有GshF酶的菌體溶于水中，菌體濃度約為100g/L，高壓均質(zhì)破碎。
[0042](2)使用氨水調(diào)節(jié)破碎后酶液的pH值至9.0，40°C放置10分鐘后，再使用磷酸將酶液pH值調(diào)至5.0，離心去除沉淀。
[0043](3)在酶液中加入0.5M氯化鎂，40°C放置10分鐘后，離心除去沉淀雜質(zhì)；
[0044](4)最后調(diào)節(jié)pH值至9.0，再加入0.4M氯化銅及0.005M氯化猛，40°C放置10分鐘后，離心收集沉淀，即為GshF酶。
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