一種調(diào)控基因在非分泌型腺毛中表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在植物非分泌型腺毛中特異表達(dá)的 萜類合成酶基因啟動(dòng)子（pr〇TPS8)及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 青蒿（ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿屬一年生草本植物，植株有濃烈的揮發(fā)性香 氣，從青蒿腺毛中提取的青蒿精油含有大量具有藥理學(xué)或者生物滅殺活性的萜類化合物和 黃酮類化合物。青蒿的葉片表面有兩種腺毛：分泌型腺毛（glandularsecretorytrichome， GST)和非分泌型腺毛（T-shapedtrichome，TST)，兩種腺毛對(duì)于植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、防御和 花粉傳播等都起到至關(guān)重要的作用。青蒿素（Artemisinin)是從其地上部分分離出的一種 含有過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前抗瘧藥中效果最好、毒性最低的藥物。青蒿素 聯(lián)合療法（Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)已成為世界衛(wèi)生組織推薦的 治療。目前青蒿素的主要來(lái)源是從青蒿的地上部分提取，然而，青蒿中青蒿素的含量非常低 (0. 01% -1% )，這使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了極大限制。
[0003]啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的特定核酸序列，能夠調(diào)控下游基因的表達(dá)，啟 動(dòng)子就像一個(gè)"開關(guān)"，通過(guò)順式作用元件和反式作用因子的相互作用來(lái)發(fā)揮其特定的功 能。啟動(dòng)子一共分三種：組成型啟動(dòng)子、特異型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在目前青蒿的基因 工程研究中，多采用組成型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子（CaMV35S)，這種啟動(dòng) 子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在所有的組織和器官中表達(dá)，會(huì)過(guò)度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，并且 不能在時(shí)間和空間上調(diào)控目的基因的表達(dá)，極可能會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成一定的負(fù)擔(dān)和 危害。
[0004]因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種在植物的組織器官中特異性表達(dá)的啟動(dòng) 子來(lái)代替組成型啟動(dòng)子，從而更好的對(duì)植物基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種在植物的組 織器官中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，從而在時(shí)間和空間上調(diào)控目的基因的表達(dá)，從而用以深入 研究非分泌型腺毛的發(fā)生和發(fā)育以及其中的次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控。
[0006] 本發(fā)明的一方面提供了一種調(diào)控基因在非分泌型腺毛中表達(dá)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子 的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。該啟動(dòng)子為既是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，又是特異型啟動(dòng)子。 該啟動(dòng)子為萜類合成酶基因啟動(dòng)子。
[0007] 進(jìn)一步地，該啟動(dòng)子上的順式作用元件包括：ABRE、HSE、LTR、MBS、 TC-richrepeats、WUN-motif〇
[0008] 本發(fā)明的另一方面提供了一種制備上述調(diào)控基因在非分泌型腺毛中表達(dá)的啟動(dòng) 子的方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟一、從青蒿基因組中克隆該啟動(dòng)子的基因組序列；其中，青蒿基因組從培養(yǎng)的 青蒿無(wú)菌苗中獲得；
[0010] 步驟二、分析該啟動(dòng)子上的順式作用元件，確定該啟動(dòng)子類型；
[0011] 步驟三、將步驟一中獲得的該啟動(dòng)子的序列與載體連接；
[0012] 步驟四、將步驟三中獲得的載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；
[0013] 步驟五、將步驟四中獲得的帶有上述載體的根癌農(nóng)桿菌穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物；該植株為 青蒿；
[0014] 步驟六、檢測(cè)上述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)入，并確定上述啟動(dòng)子所引導(dǎo)的基因在植株中的表 達(dá)部位；檢測(cè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入的方法為PCR檢測(cè)，啟動(dòng)子引導(dǎo)的基因?yàn)镚US報(bào)告基因。
[0015] 進(jìn)一步地，上述制備方法中，步驟一包括以基因組DNA為模板，采用兩輪巢式PCR 方法擴(kuò)增所述啟動(dòng)子序列；其中，巢式PCR的引物為：
[0016]
[0017]進(jìn)一步地，上述制備方法中，步驟三中的載體為pCAMBIA1391z，利用引物對(duì) 1391z-proTPS8-F和1391z-proTPS8-R，通過(guò)PCR在獲得的啟動(dòng)子序列中引入酶切位點(diǎn)PstI 和Ncol，從而連接到載體pCAMBIA1391z上，其中引物序列如下所示：
[0018] 1391z-proTPS8-F:5' -AACTGCAGGAACTGGTAAACAAAATCTGTATGC-3'；
[0019] 1391z-proTPS8-R:5' -CATGCCATGGTTCTTGAAGGCGTACTAATTACTTC-3' 〇
[0020] 進(jìn)一步地，上述制備方法中，步驟五包括：1)外植體的預(yù)培養(yǎng)；2)農(nóng)桿菌與外植體 的共培養(yǎng)；3)抗性再生植株的篩選。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種載體，該載體連接有上述調(diào)控基因在非分泌型腺毛中表達(dá)的 啟動(dòng)子。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括上述調(diào)控基因在非分泌型腺毛中表達(dá) 的啟動(dòng)子。
[0023] 本發(fā)明還提供了上述調(diào)控基因在非分泌型腺毛中表達(dá)的啟動(dòng)子用于利用植物腺 毛組織表達(dá)和在植物生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了上述的調(diào)控基因在非分泌型腺毛中表達(dá)的啟動(dòng)子在非分泌型腺 毛的發(fā)生和發(fā)育以及其中的次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控研究中的應(yīng)用。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：由于腺毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)于植物的 腺毛系統(tǒng)進(jìn)行遺傳操作，不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害，可以克服組成型啟動(dòng)子的種種 弊端。因此，克隆到植物腺毛組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)于青蒿素代謝工程具有十分重要的 意義。本發(fā)明利用有效的青蒿表皮腺毛組織特異性啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，構(gòu)建在分子 生物學(xué)中在青蒿非分泌型腺毛特異表達(dá)目的基因的融合基因，利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其轉(zhuǎn)入 其他植物的基因組中，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的定向操作以獲得轉(zhuǎn)基因植物，并且不會(huì)對(duì)植物 的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害，能廣泛用于利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種 中。
[0026] 以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR陽(yáng)性檢測(cè)。其中，Μ:分 子量標(biāo)記；1-2泳道：以轉(zhuǎn)基因陰性青蒿植株的基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物；3-7 :以轉(zhuǎn)基 因青蒿植株基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物；+ :陽(yáng)性對(duì)照；-:陰性對(duì)照。
[0028] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例的利用AaTPS8基因啟動(dòng)子與⑶S基因融合的載 體pCAMBIA1391z-pr〇TPS8通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化青蒿后，所獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中⑶S組 織染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人的《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989年 版）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0030] 本實(shí)施例涉及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細(xì)良，田云龍，郭萍，朱昌雄； 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國(guó)生物工程雜志，2008, 28(3) :38-43》文 獻(xiàn)中公開。根癌農(nóng)桿菌EHA105和質(zhì)粒pCAMBIA1391z可通過(guò)公開市售的商業(yè)渠道取得，如 可以從澳大利亞CAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambarl。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 從青蒿基因組中克隆啟動(dòng)子的基因組序列
[0033] 1、培養(yǎng)青蒿無(wú)菌苗：
[0034] 青蒿種子用體積分?jǐn)?shù)為75 %的乙醇浸泡lmin，再用20 % (w/v)的NaCIO浸泡 20min后，無(wú)菌水沖洗3次~4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于無(wú)激素的MS固體培 養(yǎng)基上，25°C、16h/8h(日光/黑夜）光照培養(yǎng)，14天后即可獲得青蒿無(wú)菌苗；
[0035]2、基因組DNA的提取
[0036] 在1. 5mL離心管中放一片青蒿葉片（1cm2左右大小，用冰盒盛取），加入2粒鋼珠。 加入300yLTPSbuffer(通風(fēng)櫥內(nèi)操作，TPS中含有巰基乙醇），55-60Hz，震蕩100秒。 再加入300μLTPSbuffer(通風(fēng)櫥）。65°C水浴lh(每隔20min搖一搖），可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí) 間，最長(zhǎng)1.5h。冷卻至室溫，4°C10000rpm離心15min。取300yL-400yL上清液。加入 300μL-400μL異丙醇（異丙醇在-20°C預(yù)冷）?；旌虾笤?20°C冰箱中放置10_15min(可 延長(zhǎng)至lh)。取出4°C離心12000rpm，吸去上清，在通風(fēng)櫥中倒置l〇-15min。加入75%乙醇 500-600μL，將沉淀吹打起或用手指彈起，放在搖床上搖15-20min，重復(fù)一次。吸干液體， 放在37°C中烘干，直到沉淀變?yōu)橥该鳌＜尤?0μLddH20回溶，即獲得基因組DNA，于4°C保 存。
[0037] 3、PCR擴(kuò)增
[0038] 以上述基因組DNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增非分泌型腺毛特異啟動(dòng)子序列。為 了提高產(chǎn)物的特異性，采用兩輪巢式PCR擴(kuò)增，根據(jù)基因組測(cè)序得到的AaTPSS基因的啟動(dòng) 子序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物如表1所示，第一輪PCR反應(yīng)體系如表2所示。PCR條件為：94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s;52°C退火30s;68°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)；68°C延伸lOmin。在 1 %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
[0039] 表1巢式PCR引物
[0040]
[0041] 表2第一輪PCR反應(yīng)體系
[0042]
[0044] 將第一輪PCR后的產(chǎn)物稀釋50倍，作為模板進(jìn)行第二輪PCR，第二輪PCR反應(yīng)體系 見表 3。PCR條件為：94°C預(yù)變性 3min;94°C變性 30s;55°C退火 30s;68°C延伸lmin4