br>[0038] 本發(fā)明進(jìn)行HRM檢測突變位點(diǎn)基因型時，按照PCR反應(yīng)程序的預(yù)選范圍，優(yōu)化基因 擴(kuò)增程序的確定，產(chǎn)物熔解條件預(yù)選范圍以及優(yōu)化條件的篩選。
[0039] 本發(fā)明中，所述PCR反應(yīng)程序預(yù)選范圍選自以下設(shè)置程序：
[0042] 經(jīng)過若干次梯度PCR和瓊脂糖凝膠電泳試驗后，最終優(yōu)化程序設(shè)置如下：
[0043] CYP3A4*1G:
[0044]
[0045] MDR1C1236T:
[0046]
[0047] 產(chǎn)物熔解條件預(yù)選范圍選自以下設(shè)置程序：
[0048] CYP3A4*1G:
[0049]
[0050] MDR1C1236T:
[0051]
[0052] 所述基因靶向區(qū)域設(shè)計引物符合優(yōu)化PCR擴(kuò)增和HRM檢測條件。本發(fā)明基因檢測 整體操作過程，其特征為所述操作包括以下步驟：
[0053] 設(shè)計待檢目的基因靶向區(qū)域連續(xù)核苷酸序列，篩選適合的引物對，所述引物設(shè)計 要按一定要求設(shè)計。根據(jù)引物條件預(yù)選PCR條件，篩選最優(yōu)PCR擴(kuò)增條件，鎖定擴(kuò)增條件之 后，再用設(shè)定的擴(kuò)增條件篩選設(shè)計的引物。提取樣本DNA，利用篩選出來的若干基因擴(kuò)增引 物，集體加樣后上機(jī)后，利用集成化反應(yīng)條件進(jìn)行基因擴(kuò)增。根據(jù)高分辨率熔解曲線法對擴(kuò) 增后的目的基因進(jìn)行突變位點(diǎn)的基因型分析。模板DNA從健康人全血樣本中提取。
[0054] 相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種檢測CYP3A4*1G和MDR1C1236T基因多態(tài)性的試劑 盒，所述的試劑盒包括針對目的基因的突變位點(diǎn)設(shè)計的特異性引物對。在本發(fā)明的一個實(shí) 施例中，所述的試劑盒針對的目的基因的檢測位點(diǎn)是CYP3A4*1G或者M(jìn)DR1C1236T。
[0055] 較好的，所述的試劑盒還包括高分辨率熔解曲線分析技術(shù)所用試劑。
[0056] 更好地，所述的試劑盒還可以包括分離提純DNA所需的試劑。
[0057] 相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0058] 利用HRM檢測突變位點(diǎn)的基因分型，達(dá)到省時省力的目的。試驗中無需序列特異 性探針，無需測序，也不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，參照對照曲線，即可完成樣本基因 型的判斷，從而簡便快速的為臨床個體化用藥提供基因信息，為合理用藥和臨床藥物監(jiān)測 提供幫助。
【附圖說明】
[0059] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例CYP3A4*1G位點(diǎn)DNA在不同退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的 電泳圖；
[0060] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例MDR1C1236T位點(diǎn)DNA在不同退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到 的電泳圖；
[0061] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例CYP3A4*1G位點(diǎn)對照基因型的高分辨率熔解曲線圖；
[0062] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例MDR1C1236T位點(diǎn)對照基因型的高分辨率熔解曲線圖；
[0063] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例CYP3A4*1G位點(diǎn)對照基因型DNA的測序圖；
[0064] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例MDR1C1236T位點(diǎn)對照基因型DNA的測序圖；
[0065] 圖7為本發(fā)明應(yīng)用健康志愿者全血DNA模板CYP3A4*1G位點(diǎn)對照基因型的高分辨 率熔解曲線圖；
[0066] 圖8為本發(fā)明應(yīng)用健康志愿者全血DNA模板MDR1C1236T位點(diǎn)對照基因型的高分 辨率熔解曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述方案做進(jìn)一步說明。
[0068] HRM基因分型技術(shù)包括特異性擴(kuò)增目的基因靶序列的引物對，所述目的基因為 CYP3A4*1G和MDR1C1236T，所述引物對為目的基因靶向區(qū)域18-27個連續(xù)核苷酸構(gòu)成的連 續(xù)核苷酸序列。
[0069] 嚴(yán)格控制摸索的PCR反應(yīng)條件和HRM分析條件。所述反應(yīng)條件包括模板的提取， 加樣的試劑成分，各個成分的反應(yīng)濃度以及PCR擴(kuò)增條件；所述HRM分析條件包括各個熔解 溫度條件。
[0070] 所述目的基因革E1序列來自Genebank。
[0071] 所述目的基因引物對為采用PrimerPremier5軟件設(shè)計。
[0072] 所述PCR反應(yīng)包括PCR緩沖液、dNTPs、Mgcl2、DNA聚合酶、引物、模板DNA和熒光 染料。
[0073]所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為：
[0074]
[0075] 優(yōu)選的，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為：
[0076]
[0077] 所述熒光染料為SYT0-9飽和性染料。
[0078] 所述dNTPs混合液包括 0· 4mMdATP、0. 4mMdTTP、0. 4mMdGTP、0. 4mMdCTP的混合 液。
[0079] 所述引物對為目的基因靶向區(qū)域18-27個連續(xù)核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核苷酸序列，配 對的正反序列為：
[0084] 優(yōu)選的，是下表序列：
[0085] CYP3A4*1G:
[0087]MDR1C1236T:
[0089]所述的模板DNA從健康人全血樣本中提取。
[0090] 本發(fā)明應(yīng)用相關(guān)的試劑盒，以及制備的DNA模板，根據(jù)本發(fā)明所述的反應(yīng)條件，在 熒光定量PCR儀上進(jìn)行序列擴(kuò)增，然后分析數(shù)據(jù)，運(yùn)行高分辨率熔解儀看熔解曲線是否是 單峰，再運(yùn)行Genescan自動分析程序，得到分型的圖譜。
[0091] 所述的突光定量PCR儀，為QiagenRotor_Gene6000 (德國Qiagen公司，杜塞爾多 夫，德國）。在使用時，將待測樣本稀釋到近似濃度，同時放入對照，加入MIX，進(jìn)行PCR反應(yīng)， 即可區(qū)分野生型與突變型。
[0092] 以下對本發(fā)明的一些專用術(shù)語進(jìn)行解釋說明：
[0093] 在本發(fā)明應(yīng)用中，術(shù)語"引物"是指一種寡核苷酸，可以使天然的也可以是合成的， 它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點(diǎn)，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核苷酸相 互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸即一種聚合試劑（即DNA聚合 酶或逆轉(zhuǎn)錄酶）存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進(jìn)行上述合成。引物的合 適長度取決于該引物的設(shè)計用途，一般在18_27bp，較短的引物分子通常需要較低的溫度， 從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不必反應(yīng)模板的準(zhǔn)確序列，但必須充分互補(bǔ)， 已與模板雜交并引發(fā)DNA合成。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，將決定PCR產(chǎn)物的大小、位 置、以及擴(kuò)增區(qū)域的1值，好的引物可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生。
[0094] 引物設(shè)計一般遵循以下原則：1)引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性； 2)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；3)引物長度一般在15~30堿基之 間；4)G+C含量在40%~60%之間；5)堿基要隨機(jī)分布；6)引物自身不能有連續(xù)4個堿基 的互補(bǔ)；7)引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)；8)引物5'端可以修飾；9)引物3'端不 可修飾；10)引物3'端要避開密碼子的第3位。進(jìn)行引物設(shè)計的軟件有Primer3、Primer5。
[0095] 本發(fā)明引物進(jìn)行篩選，確定引物片段大小,最后確定最佳引物為18_20bp大小的 引物。本發(fā)明的引物有上海生工生物有限公司（SangonBiotech(Shanghai))Co.Ltd.來合 成。
[0096] 優(yōu)選的PCR擴(kuò)增條件如下。
[0097]CYP3A4*1G:
[0098]
[0099] MDR1C1236T:
[0100]
[0101] 產(chǎn)物熔解條件預(yù)選范圍選自以下設(shè)置程序。
[0102] CYP3A4*1G:
[0103]
[0104] MDR1C1236T:
[0105]
[0106] 實(shí)施例1CYP3A4*1G引物的篩選
[0107] 以CYP3A4*1G基因為例，選用PrimerPremier軟件進(jìn)行引物設(shè)計。
[0108] CYP3A4*1G基因的序列：
[0109] (SEQIDN011)
[0111] (E表示基因突變位點(diǎn)）
[0112] 引物片段的大小會影響PCR擴(kuò)增的特異性，影響如下：
[0113]
[0114] 因此，參考上述影響，選用大小為18_23bp的引物片段進(jìn)行設(shè)計，引物由上海生工 生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行引物驗證，得出優(yōu)選的正反向引物， 見上表。圖1為本發(fā)明實(shí)施例CYP3A4*1G位點(diǎn)DNA在不同退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的 電泳圖。
[0115] 實(shí)施例2CYP3A4*1G的PCR反應(yīng)體系的確定
[0116] 所述PCR反應(yīng)包括PCR緩沖液、dNTPs、Mgcl2、DNA聚合酶、引物、模板DNA和熒光 染料，所述PCR反應(yīng)體系為（總體積為20μL):
[0117]
[0118] 實(shí)施例3CYP3A4*1G的HRM條件的確定
[0119]HRM條件的優(yōu)化主要在熔解溫度的起始溫度、每秒鐘監(jiān)測熒光的次數(shù)兩方面進(jìn)行 優(yōu)化調(diào)整。
[0120] 最佳條件：
[0121