一種快速高通量檢測細(xì)菌文庫質(zhì)粒大小的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速高通量檢測細(xì)菌文庫質(zhì)粒大小的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的微生物基因組獲得了完整的序列信息。而在這些研究領(lǐng)域，文庫的構(gòu)建成為其不可缺少的手段，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部，通過構(gòu)建各種不同大小的文庫，進(jìn)行功能片段的研究及測序，愈發(fā)顯得重要。文庫的群體大，往往需要覆蓋物種基因組的2-3倍以上，可達(dá)上萬個克隆，從文庫中篩選不同大小的目標(biāo)克隆，工作量巨大，難度也高。
[0003]常規(guī)的細(xì)菌如大腸桿菌重組質(zhì)粒篩選方法有6種:(1)A互補(bǔ)。(2)插入失活。(3)菌落原位雜交。(4)限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。(5)菌落/菌液PCR法。(6)質(zhì)粒抽提。前兩種方法盡管操作簡單但使用范圍較窄，第三和第四種方法操作繁瑣，且耗費(fèi)資金。第五種方法易出現(xiàn)假陽性。第六種方法，耗時較長，且不能實(shí)現(xiàn)高通量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，旨在提供一種快速高通量檢測細(xì)菌文庫質(zhì)粒大小的方法。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案通過對細(xì)菌重組菌的4步處理:1)溶液I進(jìn)行菌體懸?。?)溶液II進(jìn)行菌體裂解；3)溶液III除蛋白；4)DNA凝膠電泳，進(jìn)行革蘭氏陰性或陽性菌重組質(zhì)粒大小的檢測。
[0006]一種快速高通量檢測細(xì)菌文庫質(zhì)粒大小的方法，具體步驟下:
[0007]1)菌體懸浮。利用溶液I在離心管中進(jìn)行菌體懸浮。
[0008]溶液I的配方對于革蘭氏陰性菌是25mM Tris-HCl，25mM EDTA，0.02% (m/v)溴酚蘭；對于革蘭氏陽性菌是 0.2% (m/v)溶菌酶，25mM Tris-HCl, 25mM EDTA,0.02% (m/v)溴酚蘭。
[0009]2)菌體裂解。在步驟1)的離心管中加入溶液II，溶液II的配方是0.3M NaOH,2% (m/v)SDS，混勻后置于70°C水浴鍋中水浴15分鐘。
[0010]3)除蛋白。在步驟2)的離心管中加入溶液III，混勻后，12000rpm離心10分鐘，溶液III的配方是苯酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)。
[0011 ] 4)進(jìn)行DNA凝膠電泳。取步驟3)中的離心上清液直接點(diǎn)樣進(jìn)行0.8 %的DNA瓊脂糖凝膠凝膠電泳即可判斷重組質(zhì)粒插入片段的大小。
[0012]根據(jù)以上方案，優(yōu)選的，步驟1)中，在1.5ml離心管中加入12.5 μ 1-25 μ 1溶液I，并用滅菌中號移液器吸頭從富集培養(yǎng)的平板上挑取102-105CFU/cm2的1平方厘米的菌體到上述離心管中，振蕩器上振蕩5秒混勻后，丟掉吸頭。
[0013]優(yōu)選的，步驟2)中，在步驟1)的離心管中加入6.25μ 1-12.5μ1溶液II，輕輕顛倒混勻5秒。
[0014]優(yōu)選的，步驟3)中，在步驟2)的離心管中加入5 μ 1-10 μ 1溶液III，混勻5秒。
[0015]優(yōu)選的，步驟4)中，取步驟3)中的離心上清液10μ 1直接點(diǎn)樣進(jìn)行0.8%的DNA凝膠電泳，不必加上樣緩沖液。
[0016]優(yōu)選的，步驟2)中，菌體是革蘭氏陽性菌時，先將步驟1)的離心管置于50°C水浴鍋中水浴30分鐘，再繼續(xù)加入12.5 μ 1溶液II。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0018]1)本發(fā)明所述的快檢的方法不需要提出質(zhì)粒出來，4步就可以看到質(zhì)粒的大小，同時可以檢測到幾十個質(zhì)粒，只要跑膠槽數(shù)量足夠，一次性可檢測幾時甚至上百個質(zhì)粒。
[0019]2)本發(fā)明所述方法，步驟簡單，便于操作；所需試劑量少，節(jié)約成本；時間快速，2小時內(nèi)出鑒定結(jié)果；檢測數(shù)量多，較短時間內(nèi)一次性可以檢測幾十上百個樣品，可以實(shí)現(xiàn)高通量。
[0020]3)常規(guī)質(zhì)粒抽提試劑中沒有加溴酚藍(lán)檢測試劑和溶菌酶，所以只能抽提革蘭氏陰性菌如大腸桿菌，而且所需要的試劑體積也很多(一般都是100-200微升以上)，本發(fā)明方法是既可以檢測陰性菌也可以檢測陽性菌如芽胞桿菌，試劑用量少，才十幾微升即可達(dá)到效果，簡化了步驟，節(jié)約了試劑成本，達(dá)到高通量。
【附圖說明】
[0021]圖1為實(shí)施例1中獲得的大腸桿菌質(zhì)粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0022]泳道1-44 (泳道4和28除外):大腸桿菌文庫轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒
[0023]泳道4 和 28:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
[0024]圖2為實(shí)施例1中常規(guī)方法獲得的大腸桿菌質(zhì)粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0025]泳道1:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
[0026]泳道2-5:大腸桿菌質(zhì)粒
[0027]圖3為實(shí)施例2中獲得的蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0028]泳道1-44 (泳道1和26除外):蘇云金芽胞桿菌文庫轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒
[0029]泳道1 和 26:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
[0030]圖4為實(shí)施例2中常規(guī)方法獲得的蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒檢測DNA凝膠電泳圖譜。
[0031]泳道1-6:蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒
[0032]泳道7:lamda Hindlll 雙酶切 DNA marker
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明實(shí)施例所用技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)，所用試劑如未特別說明，均購自試劑耗材生物公司。
[0034]實(shí)施例1:
[0035]一種快速高通量檢測細(xì)菌革蘭氏陰性菌文庫質(zhì)粒大小的方法，其步驟如下:
[0036]本實(shí)施例所檢測的革蘭氏陰性菌文庫為E.coli DH5 α為受體菌，蘇云金芽胞桿菌基因組基因文庫(劉曉艷，蘇云金芽胞桿菌菌株CT-43中蘇云金素合成基因簇thuAB⑶EFG的克隆與合成途徑分析，博士畢業(yè)論文，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008)。
[0037]步驟A，菌體懸浮。在1.5ml離心管中加入12.5μ 1溶液I，并用滅菌中號移液器吸頭從富集培養(yǎng)的平板上挑取103-105CFU/cm2的1平方厘米的大腸桿菌到上述離心管中，振湯器上振湯混勾5秒鐘后，丟掉吸頭。
[0038]步驟B，菌體裂解。在步驟A的離心管中繼續(xù)加入6.25 μ 1溶液II，輕輕顛倒混勻5秒鐘后，置于70°C水浴鍋中水浴15分鐘。
[0039]步驟C，除蛋白。取出步驟B中的離心管，繼續(xù)加入5μ 1溶液III，振蕩器上振蕩混勻5秒鐘后，12000rpm離心機(jī)中離心10分鐘。
[0040]步驟D，進(jìn)行DNA凝膠電泳。取步驟C中的離心上清液10 μ 1，直接點(diǎn)樣進(jìn)行0.8%的DNA瓊脂糖凝膠電泳(不必加上樣緩沖液)。以空載體質(zhì)粒作為對照，即可判斷重組質(zhì)粒插入片段的大小。
[0041]溶液I 的配方為 25mM Tris-HCl, 25mM EDTA,0.02% (m/v)溴酚蘭，其余為水；
[0042]溶液II的配方為0.3M NaOH, 2% (m/v) SDS，其余為水；
[0043]溶液III為苯酚:氯仿:異戊醇按體積比25:24:1配制的混合物。
[0044]以上溶液配制時，所用的水為minipore純水儀中制備的超純水。
[0045]常規(guī)方案:
[0046]步驟A，接種大腸桿菌于5ml LB液體培養(yǎng)基中至對數(shù)生長中期。
[0047]步驟B,收集菌體，TE buffer洗滌一次。
[0048]步驟C，加100 μ 1溶液I，置冰上5’。
[0049]步驟D，加200 μ 1溶液11，快速顛轉(zhuǎn)混勻，置冰上3_5’。
[0050]步驟Ε，加150 μ 1溶液III，混勻，冰上靜置5-10’。
[0051]步驟F, 12000rpm/5’，取上清。
[0052]步驟G，苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),吸取下層液體，混勻后12000rpm，5分鐘離心，取上層液體。