一種基于lamp技術(shù)的旋毛蟲快速檢測方法及引物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于LAMP技術(shù)的旋 毛蟲快速檢測方法及引物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 旋毛蟲病是世界性分布的人獸共患寄生蟲病，該病流行于哺乳動物間，人和動物 因生吃或半熟食含旋毛蟲包囊的肉品而感染。該病危害十分嚴重，不但給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成 巨大經(jīng)濟損失，而且對人類健康帶來嚴重威脅。我國是世界上該病危害最為嚴重的少數(shù)幾 個國家之一，現(xiàn)已將其列為3大人獸共患寄生蟲?。ㄐx病，囊蟲病及棘球蝴?。┲祝?而且作為肉類進出口、屠宰動物以及我國政府提出讓人民吃上"放心肉"首檢和必檢的人獸 共患病。
[0003] 我國已發(fā)現(xiàn)多種動物能感染旋毛蟲病，分別為豬、犬、牛、貓、羊、鼠、狐貍、黃鼠狼、 貂、貉、熊及麂，除海南和臺灣尚無相關(guān)資料報道外，其它省區(qū)均已成為動物旋毛蟲病流行 區(qū)。我國豬的感染十分普遍，一些高發(fā)省份和地區(qū)，感染率高達10 %~30 %。資料顯示，我 國自1964年至2004年已暴發(fā)流行旋毛蟲病600余起，報道病例達26000余人，死亡250余 人，其中95%的病例由豬肉引發(fā)。近年來，隨著飼養(yǎng)動物及居民肉類消費量的增加，以及感 染動物種類的增多，東北及中原地區(qū)又相繼出現(xiàn)了大量由于食用狗肉、羊肉和馬肉而暴發(fā) 人旋毛蟲病，人的發(fā)病率不斷呈上升。衛(wèi)生部2001-2004年在全國組織開展的"第二次全國 人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查"結(jié)果顯示旋毛蟲病血清陽性率平均高達3. 38%，推測目前我 國人旋毛蟲病隱性感染高達4千余萬人。
[0004] 進行動物肉品旋毛蟲病的檢驗檢疫對預(yù)防該病的感染和傳播具有重大意義。目 前，我國動物旋毛蟲病的檢疫中主要使用鏡檢法和消化法，具有操作簡便等優(yōu)點，但需要檢 疫者具有很好的專業(yè)知識和經(jīng)驗，工作人員的勞動強度大，此外，肉品感染強度較低時容易 出現(xiàn)漏檢。PCR診斷技術(shù)大大提高了檢驗檢疫方法的敏感性，然而因PCR儀價格較高、擴 增產(chǎn)物需要進行電泳分析等不利因素，該方法的應(yīng)用受到很大的限制。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 (Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技術(shù)于 2000 年由Notomi等人建立， 該方法是一種快速、簡單、靈敏、特異、低成本的核酸擴增方法，在等溫條件下和較短的時間 內(nèi)可將目標基因進行大量擴增，已應(yīng)用到病毒、細菌等病原的檢測中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于LAMP技術(shù)的旋毛蟲快 速檢測方法及引物組合物。
[0006] 提供一種能快速準確檢測動物肉品和肉制品中旋毛蟲的方法。
[0007] 本發(fā)明可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 一種用于檢測旋毛蟲的特異性的LAMP引物組合物，由F3、B3、FIP和BIP四條引物 組成，F(xiàn)3、B3、FIP和BIP引物序列分別如SEQIDNO. 1-SEQIDN0. 4所示。
[0009] 本發(fā)明所述的引物組合物在制備旋毛蟲檢測試劑中的應(yīng)用。
[0010] 一種用于檢測旋毛蟲的LAMP檢測試劑盒，包含所述的特異性的LAMP引物組合物。
[0011] 所述的用于檢測旋毛蟲的LAMP檢測試劑盒，優(yōu)選包含：10μmol/L的FIP， 10ymol/L的BIP，10ymol/L的F3、10ymol/L的B3,10mmol/L的dNTPs，5mol/L甜菜堿， 0·lmol/L的MgS04,8μ/μ1 的BstDNA聚合酶，lOXBstDNAΒμffer以及ddH20。
[0012] 所述的用于檢測旋毛蟲的LAMP檢測試劑盒，還包括SYBRGreenI染料。
[0013] -種檢測旋毛蟲的方法，提取待檢樣品中全基因，以提取的DNA為模板，利用本發(fā) 明所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP擴增反應(yīng)；取LAMP擴增反應(yīng)產(chǎn)物進行1 %的 瓊脂糖凝膠電泳，如果擴增產(chǎn)物中存在其特有的階梯狀擴增條帶則表示結(jié)果為陽性，樣品 中含有旋毛蟲，如果沒有擴增條帶產(chǎn)生則表示結(jié)果為陰性；或者向LAMP擴增反應(yīng)產(chǎn)物中加 入SYBRGreenI染料，在日常光和/或紫外光下檢測，如果反應(yīng)產(chǎn)物在日常光下顯綠色、在 紫外光下產(chǎn)生強烈熒光，則表示結(jié)果為陽性，樣品中含有旋毛蟲，如果反應(yīng)產(chǎn)物在日常光下 顯橙色、紫外光下無熒光產(chǎn)生則表示結(jié)果為陰性。
[0014] 所述的檢測旋毛蟲的方法，優(yōu)選包括以下步驟：
[0015] (1)提取待檢樣品DNA;
[0016] ⑵按照以下順序分別加入：
[0017]
[0018] 將上述反應(yīng)體系充分混勻，95°C水浴鍋中孵育5min后，立即轉(zhuǎn)移至冰水中孵育 lmin，再加入BstDNA聚合酶（8U/μ1) 1μ1，充分混勻；
[0019] (3)將該反應(yīng)體系置于63°C的恒溫水浴鍋中孵育45-60min;
[0020] (4)將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到80C的丨旦溫水洛鍋中保溫10min;
[0021] (5)取5μ1反應(yīng)產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)是否能夠擴增出階梯狀擴 增條帶來判斷結(jié)果；或者向剩余的20μ1反應(yīng)產(chǎn)物中加入0. 5μ1SYBRGreenI，觀察顏色 變化判斷結(jié)果。
[0022] 本發(fā)明所述的引物組合物在檢測肉制品中旋毛蟲的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明基于LAMP檢測技術(shù)的諸多優(yōu)點，以旋毛蟲ITSII基因為分子靶標，設(shè)計其 獨特的引物，建立了旋毛蟲LAMP檢測方法，對該方法的敏感性和特異性進行了分析，并將 該檢測方法應(yīng)用于市售肉品的檢測。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果：
[0024] 1.該引物組合物和對應(yīng)的檢測方法具有特異性強、敏感性高的優(yōu)點。對旋毛蟲、 大腸桿菌、豬囊蟲、弓形蟲等不同病原進行檢測，結(jié)果能且只能從旋毛蟲樣品中獲得陽性擴 增。該檢測方法敏感性是普通PCR檢測技術(shù)的1000倍，1克肉品中含1條肌肉幼蟲時也能 檢測出來。
[0025] 2.該檢測技術(shù)操作簡便、所需時間短、不需要特殊儀器，所需試劑價格便宜，幾乎 所有實驗室都能進行操作。提取肌肉樣品中DNA后，取適量DNA至反應(yīng)緩沖液中，至恒溫水 浴鍋或培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘即可直接觀察結(jié)果。該檢測方法具有方便、快速、價廉等優(yōu) 勢。
【附圖說明】
[0026] 圖1旋毛蟲ITS-II基因的擴增
[0027] A.常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1為陰性對照（橙色），2 為旋毛蟲（綠色）
[0028]B.LAMP擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1為陰性對照（橙色），2為旋 毛蟲（綠色）
[0029]C.LAMP擴增產(chǎn)物顯色圖：1為陰性對照（橙色），2為旋毛蟲（綠色）
[0030]圖2LAMP檢測技術(shù)敏感性（模板進行梯度稀釋）
[0031] A.常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1-9分別為旋毛蟲DNA進 行 106、107、108、109、101Q、1011、1012、1013、10 14 倍稀釋
[0032]B. LAMP擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1-9分別為旋毛蟲DNA進行 ?ο6、?ο7、?ο8、?ο9、?ο10、1011、1012、1013、10 14 倍稀釋
[0033]C.LAMP擴增產(chǎn)物顯色圖：1-9分別為旋毛蟲DNA進行ΚΛ?Ο'ΚΛ?Ο'ΙΟ'ΙΟ11、 1012、1013、10 14倍稀釋，其中1~7泳道顯綠色，8、9泳道顯橙色。
[0034] 圖3LAMP檢測技術(shù)敏感性（不同旋毛蟲添加量）
[0035]A. LAMP擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1-5分別為在1克肌肉中添加 0、1、3、5、10條肌肉旋毛蟲幼蟲
[0036]B.LAMP擴增產(chǎn)物顯色圖：1-5分別為在1克肌肉中添加0、1、3、5和10條肌肉旋毛 蟲幼蟲，1泳道顯橙色，2~5泳道顯綠色。
[0037] 圖4LAMP檢測技術(shù)特異性
[0038]A.LAMP擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1-7分別為旋毛蟲、柔嫩艾美 爾球蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、弓形蟲、旋毛蟲、豬囊蟲、大腸桿菌等病原的DNA
[0039]B.LAMP擴增產(chǎn)物顯色圖：1_7分別為旋毛蟲、柔嫩艾美爾球蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、弓 形蟲、旋毛蟲、豬囊蟲、大腸桿菌等病原的DNA;1和5泳道顯綠色，其與泳道顯橙色。
[0040] 圖5LAMP檢測技術(shù)用于豬肉樣品的檢測
[0041]A.常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1為陽性對照，2-11分別 為10個不同的豬舌肌肉樣品
[0042]B.LAMP擴增產(chǎn)物電泳圖：Μ為DNA標準分子Marker，1為陽性對照，2-11分別為10 個不同的豬舌肌肉樣品
[0043] C. LAMP擴增產(chǎn)物顯色圖：1為陽性對照（綠色），2-11分別為10個不同的豬舌肌 肉樣品（橙色）。
【具體實施方式】
[0044] 基礎(chǔ)材料：
[0045] 1.旋毛蟲肌肉幼蟲：中國河南豬旋毛蟲分離株國際編號ISS534,由本實驗室保 存，經(jīng)ICR小鼠傳代。
[0046] 2.實驗動物：ICR小鼠購于揚州大學(xué)實驗動物中心。
[0047] 3.LAMP引物：F3、B3、FIP和BIP四條引物的序列分別如SEQIDNO. 1-SEQIDN0. 4 所示。
[0048] 4.PCR引物：上、下游引物（F、B)序列分別為SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所列。
[0049] 5.工具酶與試劑：Bst DNA聚合酶（lOXBst DNA Buffer聚合酶緩沖液）購自上 海研托生物科技有限公司，甜菜堿（Bataine)購自南京奧多福尼生物科技有限公司，SYBR Green I購自北京百泰克公司，rTaq(10X緩沖液）、dNTPs、DNA分子量標準物DL2000和 DL5000購自寶生物工程（TakaRa大連）有限公司，DAN提取試劑盒購自O(shè)mega公司，其余試 劑為國產(chǎn)分析純。
[0050] 6.待檢測樣品：動物舌肌樣品110份，從菜市場隨機購買，其中豬舌肌肉樣品70 份，鴨舌、雞舌、羊舌和牛舌等肌肉樣品各10份。
[0051] 7.主要儀器設(shè)備：冷凍臺式離心機（Eppendorfcentrifuge5417R)，紫外可見分 光光度計（Bio-Rad) ;PCR擴增儀（Biometra公司）隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GRP-9050型上海森 信實驗儀器有限公司）；電泳儀（DYY-11B，北京市六一儀器廠）；電熱恒溫水槽（DK-8D型上 海森信實驗儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad);電泳儀（DYY-11B，北京市六一儀器 廠）。