Rna純化方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求于2013年3月15日遞交的美國臨時申請61/799, 705的權(quán)益，為了各 種目的將其全部內(nèi)容通過引用合并于此。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于RNA純化領(lǐng)域，特別是用于制藥用途（例如用于使動物免疫）的對來 自復(fù)雜樣品（如在RNA的體外轉(zhuǎn)錄后獲得的樣品）的大型RNA的大規(guī)模純化和配制的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005]RNA作為各種制藥應(yīng)用的新型備選物出現(xiàn)，但有效純化仍是個挑戰(zhàn)。這部分由于樣 品中不希望的污染物的不同類型和組合，而需要將這些污染物從所需的RNA種類中分離以 獲得純的RNA樣品。該污染物通常為任何上游過程（例如RNA制備）的組分和和副產(chǎn)物。 當使用體外轉(zhuǎn)錄來制備大型RNA時，在轉(zhuǎn)錄成功后樣品通常含有所需的RNA種類，以及各種 污染物，如不希望的RNA種類、蛋白質(zhì)、DNA或其片段、焦磷酸酯以及游離核苷酸。
[0006] 商業(yè)的下游應(yīng)用（如作為藥物組合物和/或疫苗的制劑和用途）對用于大型RNA 的純化方法提出更多限制，其要求：（i)在保留RNA穩(wěn)定性和功能的同時獲得高純度；（ii) 與RNA的體內(nèi)遞送的制劑需求的相容性；和（iii)符合良好的制備實踐。此外，為了促進工 業(yè)應(yīng)用，任何RNA純化方法都必須確保持續(xù)、低成本且省時的操作（如快速、簡單、可重復(fù)、 高產(chǎn)率的大規(guī)模純化）。
[0007] 用于純化大型RNA的方法在本領(lǐng)域已知。Pascolo等人（2006)描述了一種從分析 規(guī)模的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)樣品中純化mRNA的方法（純化20μ1樣品體積中的25μgRNA)。該 方法涉及DNA酶處理，隨后用氯化鋰使較長的mRNA析出。然而，該作者報道該方法不提供 高純度的RNA，因為其不會完全除去污染物，如DNA和蛋白質(zhì)。此外，該方法涉及使用有機溶 劑，并且費時費力，涉及36個步驟之多，要求在不同條件下頻繁人工處理樣品，其中包括 至少一個過夜培育步驟。因此，盡管該方法可滿足研究和實驗室規(guī)模的RNA純化需求，但其 具有下列缺點：低RNA純度、重復(fù)性，并且不適合在商業(yè)規(guī)模下純化制藥級別的RNA，因而不 適合在工業(yè)過程中實踐。
[0008]W02008/077592公開了一種通過使用多孔反相固定相的離子配對反相HPLC以制 備規(guī)模純化大型RNA的方法。據(jù)報道，使用該特定的多孔固定相的特殊優(yōu)點在于，可避免壓 力過高，有助于RNA的制備性純化。然而，該方法涉及對分離柱使用有毒（harsh)有機溶劑 (如乙腈）和高溫（78°C)，而采樣器則采用低溫（12°C)。并未說明可使用該方法從所需 RNA中成功分離的污染物的性質(zhì)，也沒有說明對在先步驟（如DNA酶處理）的任何要求。此 外，基于離子配對反相HPLC或基于離子交換樹脂的RNA的色譜分離是基于分子的總電荷， 并對至多約4, 000至5, 000個堿基的RNA分子的純化有效。然而，大型RNA分子的純化經(jīng) 受尺寸排阻效應(yīng)和較差回收率的問題。此外，該方法依賴于使用有機溶劑對RNA的洗脫，但 由于殘留物的潛在安全考慮、較高的購買成本、其環(huán)境影響和對RNA穩(wěn)定性及效應(yīng)的潛在 有害影響，在理想情況下應(yīng)避免有機溶劑洗脫。
[0009] 因而仍存在對進一步改善的RNA純化方法的需求，特別是那些允許在保留RNA的 穩(wěn)定性、生物效應(yīng)和功能的同時具有高產(chǎn)率和制藥級別純度的在工業(yè)規(guī)模下對大型RNA進 行低成本且省時純化的方法。特別需要這樣的方法，其中起始樣品為復(fù)雜的生物樣品，如大 型RNA的體外轉(zhuǎn)錄后獲得的樣品。
[0010] 發(fā)明詳述
[0011] 為了解決這些需求，本發(fā)明提供了一種用于從樣品中純化RNA的方法，其包括一 個或多個正切流動過濾步驟、一個或多個羥磷灰石色譜步驟、一個或多個核心珠流通色譜 (corebeadflow-throughchromatography)步驟或它們的任意組合。這些技術(shù)可獨立 使用，當在組合使用或以特定順序進行時顯示非常高的效率。該方法可以高效的方式純化 RNA，而不會對效力或穩(wěn)定性造成不恰當?shù)钠茐?，從而提供其中RNA基本不含污染物的組合 物。此外，這些方法可無需有機溶劑來進行，并且優(yōu)選本發(fā)明的方法在水性條件下發(fā)生。本 發(fā)明的進一步的優(yōu)點為：使用基本上一次性的組分，這意味著它們可被制備為完全干凈的 形式（特別是不含RNA酶的形式），僅使用一次，然后丟掉，因此避免了操作之間一直攜帶的 污染物，這對于避免RNA酶的污染特別有效。該方法還十分快速。
[0012] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了從樣品中純化RNA的方法，其中該方法包括一 個或多個正切流動過濾步驟。
[0013] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了從樣品中純化RNA的方法，其中該方法包括 一個或多個羥磷灰石色譜步驟。
[0014] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了從樣品中純化RNA的方法，其中該方法包括 一個或多個核心珠流通色譜步驟。
[0015] 在一個有用的實施方式中，該方法包括正切流動過濾步驟和羥磷灰石色譜步驟。 正切流動過濾步驟優(yōu)選在羥磷灰石色譜步驟之前。
[0016] 在另一個有用的實施方式中，該方法包括核心珠流通色譜步驟和羥磷灰石色譜步 驟。優(yōu)選地，核心珠流通色譜步驟在羥磷灰石色譜步驟之前。
[0017] 在任一個前述實施方式中，所述RNA純化步驟之后可存在一個或多個緩沖液更換 步驟，如包括正切流動過濾。
[0018] 因而本發(fā)明提供了從樣品中純化和配制RNA的方法，其中該方法包括一個或多個 RNA純化的步驟和一個或多個緩沖液更換步驟。優(yōu)選地，至少一個緩沖液更換步驟包括正切 流動過濾。
[0019] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了純化和配制RNA的步驟，包括兩個獨立的正切 流動過濾步驟。優(yōu)選地，在第一步正切流動過濾中使用第一緩沖液，且在第二步正切流動過 濾中使用不同的第二緩沖液。第一緩沖液和第二緩沖液通?；趦煞N不同的緩沖鹽。例如， 第一緩沖液可為基于Tris的緩沖液，而第二緩沖液可為檸檬酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，第一緩 沖液為純化緩沖液，且第二緩沖液為配制緩沖液。更優(yōu)選地，純化緩沖液包含濃度在50至 500mM之間，例如250mM的鹽。
[0020] 例如，純化緩沖液可包含濃度在0至500mM之間的鹽，如約10mM、約20mM、約25mM、 約 50mM、約lOOmM、約 150mM、約 200mM、約 250mM、約 300mM、約 350mM、約 400mM、約 450mM、約 500mM、約 10mM至約 500mM、約 10mM至約 400mM、約 10mM至約 300mM、約 10mM至約 250mM、約 20mM至約 500mM、約 20mM至約 400mM、約 20mM至約 300mM、約 20mM至約 250mM、約 30mM至約 500mM、約 30mM至約 400mM、約 30mM至約 300mM、約 30mM至約 250mM、約 40mM至約 500mM、 約 40mM至約 400mM、約 40mM至約 300mM、約 40mM至約 250mM、約 50mM至約 500mM、約 50mM 至約400mM、約40mM至約300mM或約50mM至約250mM等。
[0021] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于純化和配制RNA的方法，其在正切流動 過濾步驟之前包括核心珠流通色譜的步驟。在優(yōu)選的實施方式中，在核心珠流通色譜步驟 中使用第一緩沖液，并在正切流動過濾的步驟中使用第二緩沖液。優(yōu)選地，第一緩沖液為純 化緩沖液，且第二緩沖液為不同的配制緩沖液。更優(yōu)選地，純化緩沖液包含鹽，如氯化鉀或 氯化鈉。最優(yōu)選地，純化緩沖液包含濃度在100至500mM之間，如250mM的氯化鉀。
[0022] 例如，純化緩沖液可包含濃度在0至500mM之間的氯化鉀，如約50mM、約75mM、約 100mM、約 150mM、約 200mM、約 250mM、約 300mM、約 350mM、約 400mM、約 450mM、約 500mM、約 50mM至約 500mM、約 50mM至約 400mM、約 50mM至約 300mM、約 50mM至約 250mM、約 75mM至約 500mM、約 75mM至約 400mM、約 75mM至約 300mM、約 75mM至約 250mM、約 100mM至約 500mM、 約100mM至約400mM、約100mM至約300mM、或約100mM至約250mM等。
[0023] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于純化和配制RNA的方法，其包括第一步 正切流動過濾，然后第二步羥磷灰石色譜，然后第三步正切流動過濾。在優(yōu)選的實施方式 中，在第一步正切流動過濾中使用第一緩沖液，在第二步羥磷灰石色譜中使用不同的第二 緩沖液，并在第三步正切流動過濾中使用不同的第三緩沖液。優(yōu)選地，第一和第二緩沖液為 純化緩沖液，且第三緩沖液為不同的配制緩沖液。優(yōu)選地，第一緩沖液不含氯化鈉和/或氯 化鉀。最優(yōu)選地，在另一步驟中，在第一步正切流動過濾之后和第二步羥磷灰石色譜之前， 將氯化鈉和/或氯化鉀加入含RNA的樣品中，直至達到100至500mM之間的最終濃度，如 250mM或 500mM。
[0024] 例如，可向含RNA的樣品中加入氯化鈉和/或氯化鉀，直至達到0至500mM之間的 最終濃度，如約 50mM、約 75mM、約 100mM、約 150mM、約 200mM、約 250mM、約 300mM、約 350mM、 約 400mM、約 450mM、約 500mM、約 50mM至約 500mM、約 50mM至約 400mM、約 50mM至約 300mM、 約 50mM至約 250mM、約 75mM至約 500mM、約 75mM至約 400mM、約 75mM至約 300mM、約 75mM 至約 250mM、約 100mM至約 500mM、約 100mM至約 400mM、約 100mM至約 300mM、或約 100mM至 約250mM等。
[0025] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于純化和配制RNA的方法，其包括第一步 核心珠流通色譜，然后第二步羥磷灰石色譜，然后第三步正切流動過濾。在優(yōu)選的實施方式 中，在第一步核心珠流通色譜中使用第一緩沖液，在第二步羥磷灰石色譜中使用不同的第 二緩沖液，并在正切流動過濾中使用不同的第三緩沖液。優(yōu)選地，第一和第二緩沖液為純化 緩沖液，且第三緩沖液為不同的配制緩沖液。優(yōu)選地，第一緩沖液不含氯化鈉和/或氯化 鉀。最優(yōu)選地，在另外的步驟中，在第一步核心珠流通色譜之后和第二步羥磷灰石色譜之前 將氯化鈉和/或氯化鉀加入含RNA的樣品中，直至達到100至500mM之間，如250mM或500mM 的最終濃度。
[0026] 例如，可向含RNA的樣品中加入氯化鈉和/或氯化鉀，直至達到0至500mM之間的 最終濃度，如約 50mM、約 75mM、約 100mM、約 150mM、約 200mM、約 250mM、約 300mM、約 350mM、 約 400mM、約 450mM、約 500mM、約 50mM至約 500mM、約 50mM至約 400mM、約 50mM至約 300mM、 約 50mM至約 250mM、約 75mM至約 500mM、約 75mM至約 400mM、約 75mM至約 300mM、約 75mM 至約 250mM、約lOOmM至約 500mM、約lOOmM至約 400mM、約lOOmM至約 300mM、或約lOOmM至 約250mM等。
[0027] 本發(fā)明還提供了用于從樣品（如體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物）中純化RNA的方法，其中 在低于12小時內(nèi)（如〈8小時、〈6小時、〈4小時或〈2小時），該RNA被純化至至少99%的 純度（如彡99. 9%或甚至彡99. 95% )。
[0028] 在本發(fā)明的方法中，其步驟通常涉及丟棄不含RNA(或不含所需的RNA種類）的物 質(zhì)，同時留下含有RNA(或所需RNA種類）的物質(zhì)。因而，當一種技術(shù)將起始物分為幾部份 時，將保留所需部分同時可丟棄不需要的部分；類似地，如果一種技術(shù)保留不希望的部分但 使所需RNA流出，則應(yīng)保留流出液。
[0029] RNA
[0030] 根據(jù)本發(fā)明，從含RNA的樣品中純化所需的RNA。本發(fā)明的所需RNA可為雙鏈，但 優(yōu)選為單鏈。當RNA為單鏈時，如mRNA或自我復(fù)制的RNA復(fù)制子時，其通常編碼一種或多 種蛋白，并且其中至少一種可用作下述的免疫原，但也可為任意感興趣的非免疫原性治療 性或預(yù)防性蛋白（如作為基因治療藥物的組分）。本發(fā)明所需的RNA可為環(huán)形，但優(yōu)選為鏈 形。
[0031]RNA可為負鏈，但優(yōu)選為正鏈，這樣其可不需任何中間復(fù)制步驟（如反轉(zhuǎn)錄）就被 細胞翻譯。優(yōu)選的正鏈RNA為自我復(fù)制，如下所述。優(yōu)選地，RNA不是天然病毒RNA。
[0032]RNA可為小型、中型、大型RNA。小型RNA每條鏈的核苷酸數(shù)為10至30 (如siRNA)。 中型RNA每條鏈含有30至2000個核苷酸（如非自我復(fù)制的mRNA)。大型RNA每條鏈含有 至少2, 000個核苷酸，如每條鏈至少2, 500個、至少3, 000個、至少4, 000個、至少5, 000個、 至少6, 000個、至少7, 000個、至少8, 000個、至少9, 000個、或至少10, 000個核苷酸（如 下述的自我復(fù)制的RNA)。以g/mol(或道爾頓）給出的單鏈RNA分子的分子量可大約使用 以下公式計算：分子量=(RNA核苷酸數(shù)）x340g/mol。
[0033] 如在W02011/005799中討論的，RNA(特別是自我復(fù)制的RNA)除了任何5'帽結(jié)構(gòu) 外還可包括一個或多個具有修飾的核堿基的核苷酸。例如，RNA可包括一個或多個修飾的 嘧啶核堿基，如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶殘基。然而，在一些實施方式中，RNA包括無修 飾的核堿基，并且可包括無修飾的核苷酸，即RNA中的所有核苷酸為標準A、C、G和U核糖核 苷酸（除了任何5'帽結(jié)構(gòu)，其可包括7'-甲基鳥苷）。在其它實施方式中，RNA可包括包 含7' -甲基鳥苷的5'帽，并且第一 1、2或3、5'核糖核苷酸可在核糖的2'位被甲基化。
[0034] 本申請使用的RNA優(yōu)選地僅在核苷之間包括磷酸二酯連接基，但在一些實施方式 中其可包含氨基磷酸酯連接基、硫代磷酸酯連接基和/或甲基磷酸酯連接基。
[0035] 本發(fā)明尤其適合自我復(fù)制的RNA的純化。當被遞送至脊椎動物細胞時，即使沒有 任何蛋白，自我復(fù)制的RNA分子（復(fù)制子）也可通過其自身的轉(zhuǎn)錄（通過由其自身產(chǎn)生的 反義副本）產(chǎn)生多個子RNA(daughterRNA)。因而自我復(fù)制的RNA分子通常為正鏈分子，其 在被遞送至細胞后可被直接翻譯，并且該翻譯提供了由RNA依賴性RNA聚合酶，該RNA依賴 性RNA聚合酶隨后從被遞送的RNA中產(chǎn)生反義和正義轉(zhuǎn)錄本。因而被轉(zhuǎn)錄的RNA導致產(chǎn)生 多個子RNA。這些子RNA以及共線亞基因組轉(zhuǎn)錄本自身可被翻譯以提供感興趣的被編碼 蛋白（如免疫原）的原位表達，或可被轉(zhuǎn)錄以提供與被遞送的RNA同義的進一步的轉(zhuǎn)錄本， 其被翻譯而提供蛋白（如免疫原）的原位表達。該轉(zhuǎn)錄序列的總體結(jié)果為所引入的復(fù)制子 RNA數(shù)量的巨幅擴增，且因此被編碼的免疫原成為細胞的主要多肽產(chǎn)物。在W02012/006369 和TO2013/006838種公開了合適的自我復(fù)制的RNA。
[0036] 實現(xiàn)自我復(fù)制的一種合適的系統(tǒng)為使用基于α病毒的RNA復(fù)制子。在被遞送至 細胞后，這些正鏈復(fù)制子被翻譯以產(chǎn)生復(fù)制酶（或復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶）。復(fù)制酶被翻譯為多聚 蛋白，其自動剪切以提供產(chǎn)生被遞送的正鏈RNA的基因組負鏈副本的復(fù)制復(fù)合體。這些負 鏈轉(zhuǎn)錄本自身可被轉(zhuǎn)錄以提供正鏈母RNA的進一步的副本，還提供編碼免疫原的亞基因組 轉(zhuǎn)錄本。亞基因組轉(zhuǎn)錄本的翻譯因而導致被感染細胞原位表達免疫原。合適的α病毒復(fù) 制子可使用來自辛德比斯病毒、西門利克森林病毒、東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 等的復(fù)制酶?？墒褂猛蛔冃突蛞吧筒《拘蛄?，如在復(fù)制子中使用VEEV的減弱TC83突變 體（W02005/113782)。
[0037]